不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠心肌PAI-1及血清NO、NOS的影響

王仁綱 徐國(guó)琴 翁錫全 孟艷 林文弢

廣州體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)生化省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣州 510500）

糖尿病并發(fā)癥，尤其是心、腦等的血管病變是導(dǎo)致糖尿病死亡的主要原因，嚴(yán)重威脅患者生活質(zhì)量及生存年限。據(jù)報(bào)道，糖尿病患者的全部死亡原因中，約30%為心肌梗死［1-3］。有研究提出，糖尿病患者心臟纖溶酶原激活物抑制劑-1 （PAI-l）升高［4］，引起纖維蛋白降解障礙，纖維蛋白原在血管內(nèi)皮上堆積而產(chǎn)生血栓，是導(dǎo)致糖尿病心肌病發(fā)病的重要因素之一，而一氧化氮（NO）具有抑制PAI-1水平，改善纖溶系統(tǒng)的作用，在心血管疾病發(fā)生中有重要意義［5］。目前，運(yùn)動(dòng)療法是安全、簡(jiǎn)便、有效的糖尿病治療方式，其有效性已在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中得到有力證實(shí)［6-8］。但有關(guān)心血管纖溶系統(tǒng)的報(bào)道多限于運(yùn)動(dòng)對(duì)血液PAI-1的影響，本研究以高脂高糖膳食并腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）建立糖尿病大鼠模型，觀察不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后糖尿病大鼠心肌組織PAI-1及血清NO、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、總一氧化氮合酶（T-NOS）的變化，探討運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠心血管舒張功能及血液凝聚功能的影響，揭示運(yùn)動(dòng)防治糖尿病并發(fā)心肌病的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型及分組

SPF級(jí)健康6周齡雄性SD大鼠87只，體重190±15 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（粵監(jiān)證字2007A003）。自由飲食，飼養(yǎng)和運(yùn)動(dòng)時(shí)室溫20℃～25℃，空氣濕度40%～60%，自然晝夜節(jié)律，光線充足。

大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后給予高脂飼料喂養(yǎng)，其飼料配方為豬油10%、白糖20%、蛋黃粉5%、膽鹽0.2%、維生素0.05%、礦物質(zhì)0.2%、基礎(chǔ)飼料64.55%，原料來(lái)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心并由其加工制作。參照文獻(xiàn)［9，10］進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)并建立糖尿病大鼠模型，即飼養(yǎng)6周后所有高脂飲食大鼠禁食12小時(shí)后稱量空腹體重，并按30 mg/kg體重的劑量于左下腹一次性腹腔注射STZ緩沖液（20 mg/m l），所配制STZ溶液30分鐘內(nèi)注射完畢。注射3天后對(duì)大鼠進(jìn)行尿糖定性檢測(cè)，連續(xù)3天目測(cè)尿糖結(jié)果為+++~++++，第7天測(cè)試大鼠尾靜脈全血血糖，16.7 mmol/L（300 mg/d1）以上者確定為糖尿病大鼠［11］。結(jié)果糖尿病大鼠造模成功81只，成功率為93.1/%。從造模成功的糖尿病大鼠中隨機(jī)選取43只，分為糖尿病安靜對(duì)照組（DMC）10只，糖尿病運(yùn)動(dòng)1組（DME1）、2組（DME2）和3組（DME3），每組11只。運(yùn)動(dòng)各組進(jìn)行跑臺(tái)（BCPT-98型）運(yùn)動(dòng)，依據(jù)Bedford等的推薦［12］分為小、中、大3種強(qiáng)度，即DME1組跑速為10 m/min（相當(dāng)于30%VO2max強(qiáng)度），DME2組為15 m/min（相當(dāng)于50%VO2max強(qiáng)度），DME3組為20 m/min（相當(dāng)于70%VO2max強(qiáng)度），每天1 h，其余時(shí)間自由活動(dòng)，每周5天，持續(xù)6周。由于高血糖、運(yùn)動(dòng)等原因造成實(shí)驗(yàn)中大鼠少量死亡，最終取材時(shí)各組樣本量為DMC組、DME1組、DME3組每組各10只、DME2組9只。

1.2 樣品采集與處理

各組大鼠在第6周末次干預(yù)后禁食約12 h，稱重，尾部靜脈取血（測(cè)試血糖）后即刻腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置1 h，3000 r/min離心20 min后分離血清，置-70℃超低溫冰箱保存，用于血清指標(biāo)測(cè)試。取心肌組織0.5克用4℃預(yù)冷的生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干水份后稱重，按1:9比例加入生理鹽水置勻漿機(jī)上10 000 r/min勻漿10 s×3次，制備10%勻漿，4℃以下2000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)試心肌PAI-1含量。

1.3 測(cè)試指標(biāo)與方法

血糖（FBG）采用日本京都GT-1640血糖儀測(cè)試；糖化血清蛋白（GSP）采用果糖胺法測(cè)試，儀器為S22PC分光光度計(jì)，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供；采用ELISA測(cè)試血清胰島素（FINS），血清NO、eNOS、T-NOS和心肌組織PAI-1，儀器為RT-2100C型多功能酶標(biāo)儀，試劑盒由美國(guó)ADL公司提供。所有測(cè)試步驟嚴(yán)格按試劑盒要求操作；胰島素抵抗指數(shù)（IRI）采用國(guó)際通用的Homa Model公式計(jì)算［13］：胰島素抵抗指數(shù)（IRI）=（FBG×FINS）÷22.5。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，各組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P < 0.05為顯著性差異，P < 0.01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG、GSP、FINS及IRI比較

由表1可知，6周實(shí)驗(yàn)后，與DMC組比較，3個(gè)運(yùn)動(dòng)組FBG顯著下降（P < 0.01）；運(yùn)動(dòng)各組GSP出現(xiàn)不同程度下降，其中DME1組和DME2組下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；運(yùn)動(dòng)各組FINS均升高，僅DME3組升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且DME1組、DME2組顯著低于DME3組（P <0.05）；DME1 組、DME2 組 IRI顯著下降（P < 0.05），而DME3組上升，與DMC組相比無(wú)顯著差異（P> 0.05），且顯著高于DME1、DME2組（P < 0.01，P < 0.05）。

表1 各組大鼠空腹血糖、糖化血清蛋白、胰島素及胰島素抵抗指數(shù)比較

2.2 各組大鼠NO、eNOS、T-NOS及PAI-1比較

表2顯示，6周實(shí)驗(yàn)后，與DMC組相比，各運(yùn)動(dòng)組大鼠血清NO均顯著升高（P < 0.05，P <0.01）；血清 eNOS 均顯著升高（P < 0.05，P < 0.01）；DME1組T-NOS顯著升高（P < 0.05）；各運(yùn)動(dòng)組心肌PAI-1均顯著降低（P < 0.05，P < 0.01）。

表2 各組大鼠NO、eNOS、T-NOS、PAI-1比較

3 討論

3.1 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠FBG、GSP、FINS及IRI的影響

控制血糖水平是治療糖尿病和防治糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵［6，14］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠6周不同強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后，空腹血糖和糖化血清蛋白均呈不同程度降低，以中小強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)效果最明顯。說(shuō)明一定強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)能降低糖尿病大鼠血糖，改善高血糖癥狀，對(duì)糖尿病的干預(yù)治療是有效的。同時(shí)，DME1和DME2組血FINS有升高趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而IRI顯著下降，表明6周低、中強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)能提高胰島素敏感性，減輕大鼠胰島素抵抗程度，其效果與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度有關(guān)。其機(jī)制為規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)作為一種高能耗的刺激，可加強(qiáng)機(jī)體組織細(xì)胞攝取和利用葡萄糖，改善和提高機(jī)體組織細(xì)胞的胰島素敏感性。

3.2 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠心肌PAI-1含量的影響

PAI-l為單鏈糖蛋白，其活性增加對(duì)組織型纖溶酶激活物（t - PA）和尿激酶型纖溶酶原激活物（u- PA）起抑制作用。糖代謝紊亂時(shí)，引起心臟PAI-l升高［4］，使纖溶酶原生成減少，纖維化和血栓形成，導(dǎo)致心肌缺血、缺氧，最終演變?yōu)樘悄虿⌒募〔?。研究發(fā)現(xiàn)，急性運(yùn)動(dòng)迅速升高血漿纖溶活性，其作用與運(yùn)動(dòng)的劇烈程度和持續(xù)時(shí)間相關(guān)；次極量運(yùn)動(dòng)（40%最大運(yùn)動(dòng)量持續(xù)30 min）可使纖溶活性中度升高。運(yùn)動(dòng)增加纖溶活性的機(jī)制可能是促進(jìn)血管內(nèi)皮釋放纖溶酶原活化因子，參與纖溶調(diào)節(jié)，或通過(guò)運(yùn)動(dòng)減少腹部脂肪，使脂肪細(xì)胞合成的PAI-1減少［15］。此外，不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)PAI-1的影響結(jié)果不同，低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)PAI-1活性影響較小，力竭性運(yùn)動(dòng)可使PAI-1活性上升，而中等負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可降低PAI-1活性，有效預(yù)防血栓性疾?。?6，17］。其機(jī)制可能為適當(dāng)運(yùn)動(dòng)可使兒茶酚胺和腦垂體后葉釋放PA釋放激素（PARH）分泌增多，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞合成與釋放t-PA，進(jìn)而抑制PAI-1生成，有效增加血纖溶活性［18，19］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠6周運(yùn)動(dòng)后，各運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌PAI-1與糖尿病對(duì)照組相比均顯著下降。這與上述研究結(jié)果一致。但由于本實(shí)驗(yàn)缺少正常對(duì)照組，對(duì)不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)降低心肌PAI-1，改善纖溶系統(tǒng)及防治糖尿病并發(fā)心肌病的生物學(xué)機(jī)制還有待探討。

3.3 不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠血清NO、eNOS、T-NOS的影響

NO水平在一定程度上反映糖尿病心肌血管損傷的程度，其代謝失?？赡苁菍?dǎo)致糖尿病心肌病的機(jī)制之一［20］。NOS是合成NO的關(guān)鍵酶，有3種亞型：神經(jīng)源型一氧化氮合酶（nNOS）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）。iNOS催化產(chǎn)生的NO發(fā)揮較強(qiáng)的自由基效應(yīng)，而eNOS催化產(chǎn)生的NO為強(qiáng)有力的內(nèi)源性血管舒張因子，對(duì)血管有較強(qiáng)的保護(hù)作用，抑制血管平滑肌增殖，減少血小板黏附，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化及氧自由基的產(chǎn)生，使細(xì)胞免受超氧陰離子損傷［21］。

長(zhǎng)期有氧運(yùn)動(dòng)不僅增加eNOS活性，也上調(diào)eNOS mRNA表達(dá)，增加NO合成量，促進(jìn)內(nèi)皮依賴性的舒張反應(yīng)，進(jìn)而防治心血管疾病［22］。王玉等研究發(fā)現(xiàn)，12周有氧運(yùn)動(dòng)在改善糖尿病患者心率變異的同時(shí)，提高了血漿NO水平［23］。適宜負(fù)荷的游泳訓(xùn)練也可提高大鼠心肌與血清e(cuò)NOS活性，改善心血管系統(tǒng)功能；而長(zhǎng)時(shí)間過(guò)度負(fù)荷的游泳訓(xùn)練可使大鼠心肌與血清iNOS活性升高，引起心血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，影響心血管功能［24］。本研究結(jié)果顯示，糖尿病大鼠6周運(yùn)動(dòng)后，運(yùn)動(dòng)各組eNOS與DMC組相比顯著升高，僅DME1組T-NOS顯著升高，這可能與T-NOS是三種NOS的總和，影響因素較多，個(gè)體差異大有關(guān)，T-NOS不高還間接說(shuō)明iNOS較低對(duì)心肌組織有利。另外，3種強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組糖尿病大鼠血清NO均顯著升高，這與王玉、孫紅梅等的研究［23，24］結(jié)果一致，且eNOS和NO的變化有強(qiáng)度依賴性，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)更有利于提高糖尿病大鼠血清NO水平。

4 總結(jié)

6周不同強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)可降低糖尿病大鼠心肌PAI-1含量，提高血清e(cuò)NOS活性和NO水平，對(duì)糖尿病心肌病起到一定的預(yù)防與控制作用。

6周不同強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠心肌PAI-1和血清e(cuò)NOS活性、NO水平的影響有一定的強(qiáng)度依賴性。

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