兩面針總堿對大鼠局灶性腦缺血的保護作用

徐 露

重慶醫(yī)科大學（重慶 400016）

兩面針總堿對大鼠局灶性腦缺血的保護作用

徐 露

重慶醫(yī)科大學（重慶 400016）

目的 研究兩面針總堿對大鼠局灶性腦缺血的保護作用。方法 采用線栓法造成大鼠右側大腦中動脈永久性阻塞模型。通過大鼠神經行為學評分、腦梗死指數、腦質量指數及腦組織病理學改變及生化檢測等指標，觀察3種劑量的兩面針總堿對急性腦缺血的作用，尼莫地平為陽性對照。結果 與模型組相比，兩面針總堿高、中劑量組腦缺血大鼠神經癥狀明顯減輕，血清中超氧化物歧化酶含量上升，丙二醛含量降低，腦梗死指數和腦指數降低；HE染色顯示各組神經元和組織間隙水腫程度明顯減輕；而兩面針總堿低劑量組所有指標與模型組差異不明顯。結論高、中劑量的兩面針總堿有明顯的抗急性腦缺血作用。

兩面針總堿 MCAO 局灶性腦缺血 TTC 梗死指數

缺血性腦血管病是當今死亡率和致殘率較高的疾病之一。尼莫地平是一種腦保護劑，能有效地阻止Ca2+進入細胞內、抑制平滑肌收縮，達到解除血管痙攣，增加腦血流量的目的。兩面針系蕓香科花椒屬植物，具有驅風化濕、消腫止痛之功效，主要用于治療風濕關節(jié)痛、跌打扭傷腫痛 、神經痛、牙痛等。兩面針生物堿為其主要有效成分。本文觀察兩面針總堿對急性腦缺血的治療作用，為開發(fā)廉價有效的腦梗死治療藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 兩面針總堿超氧化物歧化酶購自安徽致和堂藥業(yè)有限公司（批號：20090108，純度＞85%）；尼莫地平購自武漢遠城醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司（純度98%，批號：20090212）；氯化三苯基四氮唑（TTC）（Sigma 公司分裝進口，批號：090820001）；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20090318）；丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20090318）

1.2 分組及給藥 SD大鼠 （由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供），體質量200～250g，雌雄兼用。隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平陽性對照組、兩面針總堿組高、中、低劑量組，每組15只。各組均于術后3、6、12h灌胃給藥。尼莫地平組按4mg/kg的劑量灌胃給藥，兩面針總堿高、中、低劑量組按照400、200、100mg/kg灌胃給藥。假手術組及模型組灌胃等量溶劑。

1.3 模型制備 采用線栓法制備大腦中動脈閉塞（MCAO）模型。用4.5%水合氯醛1mL/100g腹腔注射麻醉。頸部正中切口，分離右頸總動脈及頸內、頸外動脈。在距頸動脈分叉5mm處，雙線結扎頸外動脈，頸內動脈穿線備用，結扎右頸總動脈的近心端。在靠近動脈分叉的頸總動脈壁上剪一小口，插入一直徑為0.2mm的尼龍魚線（頭端用石蠟薄薄地包裹），經頸內動脈進入大腦中動脈起始部，以阻斷大腦中動脈的血流。插入線長約16mm時，有明顯阻力感。結扎頸內動脈及尼龍線，防止插線脫落。假手術組除不插入尼龍線外其他手術步驟相同。

1.4 神經功能缺損程度評分 腦缺血24h后進行神經缺陷評分，采用5分制評分法。評分標準：0分為無神經缺陷，活動正常；1分為左前爪不能充分伸展；2分為大鼠向左側轉圈；3分為大鼠向左側傾倒；4分為不能自主運動，精神萎靡。

1.5 腦梗死指數及腦指數測定 大鼠行為學評分后稱取體質量，斷頭處死，取腦（切除小腦和嗅球），每組選取10個腦稱質量。大腦置于-20℃低溫冰箱中凍存30min，然后平均冠狀切成5片，每片約厚1～2mm，置入2%氯化三苯基四氮唑磷酸緩沖液（pH7.4）中，37℃恒溫水浴中孵育20min，取出后用甲醛固定。正常腦組織染成紅色，白色部分為缺血區(qū)，將其用小刀剔出，稱質量。 腦梗死指數=梗死灶濕質量（g）／腦濕質量（g）×100%；腦指數=腦濕質量（g）／體質量（g）×100%。

1.6 血清中SOD、MDA含量檢測 大鼠斷頭后取血，4℃放置2h，取上層血清，用SOD、MDA試劑盒檢測血清中SOD和MDA含量。SOD活性采用鄰苯三酚自氧化法測定，MDA含量采用TBA法測定。

1.7 病理組織檢查 每組剩余的5個腦組織置10%甲醛中固定，經脫水、浸蠟、包埋、切片后，HE染色，光鏡下觀察組織病理學變化。

2 結 果

2.1 大鼠神經功能缺陷程度評分及SOD、MDA含量檢測結果見表1。尼莫地平和兩面針總堿高、中劑量組均能降低大鼠神經功能缺陷程度評分 （P＜0.05或0.01），且三者作用相似 （P＞0.05），兩面針總堿低劑量與模型組比較無差異，與尼莫地平相比有顯著差異（P＜0.01）。與模型組比較，尼莫地平和兩面針總堿高、中劑量組能提高大鼠血清中的SOD含量，降低MDA含量（P＜0.05或 0.01），且 3組間無明顯差異（P＞0.05）。 而兩面針總堿低劑量組與模型組相比無明顯差異（P＞0.05），與尼莫地平組差異顯著（P＜0.05或 0.01）。

表1 各組大鼠神經功能缺損程度評分及SOD和MDA含量比較 （±s）

表1 各組大鼠神經功能缺損程度評分及SOD和MDA含量比較 （±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與尼莫地平組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

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2.2 各組腦梗死指數及腦指數比較 見表2。與模型組相比，尼莫地平和兩面針總堿高、中劑量組能明顯降低大鼠腦梗死指數（P＜0.05或 0.01）和腦指數（P＜0.05），而兩面針總堿低劑量組與模型組無明顯差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠腦梗死指數及腦指數比較 （%，±s）

表2 各組大鼠腦梗死指數及腦指數比較 （%，±s）

組 別 n 腦梗死指數假手術組 10 0腦指數0.53±0.02*模型組 10 26.75±5.32**0.67±0.11尼莫地平組 10 14.44±3.27** 0.58±0.06*兩面針總堿高劑量組 10 14.36±3.54** 0.55±0.05*兩面針總堿中劑量組 10 15.22±4.83** 0.57±0.06*兩面針總堿低劑量組 10 27.12±5.71△△0.65±0.09△

2.3 病理組織學檢查 模型組梗死側腦組織水腫現象明顯，神經元腫脹，周圍間隙擴大，胞核濃縮，對側腦組織未見病理改變。尼莫地平和兩面針總堿高、中劑量組患側蒼白區(qū)縮小，光鏡下顯示梗死側腦細胞水腫程度均明顯減輕，梗死范圍明顯減小，且神經元細胞形態(tài)較規(guī)則。提示高、中劑量的兩面針總堿能減輕腦水腫，維持神經元細胞形態(tài)的正常，有利于腦損傷的修復。

圖1 各組大鼠腦組織病理切片（×40）

3 討 論

建立缺血性腦損傷模型，經常采用的動物模型有全腦和局灶性腦缺血模型。臨床上常見的是局部或區(qū)域性腦缺血，梗死多發(fā)生在大腦中動脈。本實驗采用的MCAO模型與臨床常見的腦卒中情況相似。

腦缺血導致神經元損傷的原因有很多觀點，比較公認的有自由基學說、鈣超載、興奮性氨基酸毒性等。正常情況下，腦內細胞可由SOD，過氧化氫酶等來清除自由基［1］。缺血缺氧情況下，由于花生四烯酸等活化產生過多的自由基，由于自由基的鏈鎖反應，進一步加重膜性結構的破壞和線粒體功能障礙，引起缺血損傷。所以，本實驗中能觀察到模型組腦神經元質膜破裂，水腫加重［2-5］。

本實驗發(fā)現：高、中劑量的兩面針總堿能夠明顯降低MCAO腦缺血模型大鼠的神經功能缺損程度評分、提高血清SOD含量、降低MDA含量、降低腦梗死指數和腦指數、改善腦病理形態(tài)，作用效果和尼莫地平相似。其作用機理可能是通過清除自由基而起到抑制細胞膜過氧化作用，從而對腦的細胞穩(wěn)定起到積極的作用。本實驗還發(fā)現，低劑量的兩面針總堿對腦梗死的治療無明顯作用，說明其存在一定的量效關系。

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1004-745X（2011）08-1261-02

2011-01-05）