盛小波,木泰華
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京100193)
超高壓對(duì)牛乳清蛋白水解影響的研究進(jìn)展
盛小波,木泰華*
(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京100193)
主要綜述了國(guó)內(nèi)外關(guān)于超高壓處理對(duì)牛乳清蛋白水解及其產(chǎn)物功能特性影響的研究進(jìn)展,并展望了超高壓處理在酶法制備乳清蛋白生物活性肽方面的應(yīng)用前景。
超高壓,蛋白水解,β-乳球蛋白,功能特性
牛乳中的蛋白質(zhì)含有人體所需的必需氨基酸,并可以很好地被人體利用,在促進(jìn)機(jī)體組織的生長(zhǎng)、康復(fù)和增強(qiáng)抵抗力方面有著重要作用。根據(jù)牛乳蛋白在pH4.6條件下的溶解性可將其分為兩類(lèi):可溶性的為乳清蛋白,約占全奶蛋白總含量的20%;不溶性的為酪蛋白,占80%左右[13]。β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La)是牛乳清蛋白的主要組成成分,分別占其總量的55%~60%和15%~20%。此外,還有少量的牛血清蛋白(BSA)、免疫球蛋白(Ig)、乳鐵蛋白、磷脂蛋白、生物活性因子和酶等[35]。乳清蛋白中的β-Lg被認(rèn)為是牛乳中最主要的過(guò)敏原,在食品工業(yè)中乳清有的作為廢物進(jìn)行處理,還有的被加工成商業(yè)乳清粉、乳清分離蛋白和乳清濃縮蛋白等產(chǎn)品。采用蛋白質(zhì)水解和熱處理技術(shù)可在一定程度上降低牛乳的抗原性,且水解后的乳清蛋白還具有較好的物化和功能特性,因而蛋白水解技術(shù)在食品工業(yè)中已受到越來(lái)越多的重視[28-30]。近來(lái),乳清蛋白肽還被用于一些特殊的食品配方,如老年產(chǎn)品、高能補(bǔ)充食品、體重控制產(chǎn)品、膳食性治療及嬰幼兒食品等[5]。近年來(lái),包括超高壓技術(shù)在內(nèi)的一批新型的食品加工技術(shù)引起了人們的廣泛關(guān)注,這些非熱加工技術(shù)不僅能實(shí)現(xiàn)熱處理預(yù)期的加工效果,而且還能降低食品中有害微生物菌群的數(shù)量、維持食品原有的感官和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì),并能保留其中的熱敏性營(yíng)養(yǎng)成分,如維生素等[16,31]。作為一種加工方法,超高壓作用于蛋白水解不僅可用于常壓條件下不能被蛋白酶水解或水解程度較低的蛋白,以提高其水解進(jìn)程,改變水解產(chǎn)物的物化特性,還可能產(chǎn)生一些新的具有特殊生理活性的功能性肽。超高壓技術(shù)對(duì)乳清蛋白及其水解作用的影響,更引起了各國(guó)研究者的重視,并開(kāi)展了一系列此類(lèi)研究。
1.1 超高壓對(duì)乳清蛋白及其構(gòu)成蛋白的影響
采用超高壓技術(shù)對(duì)牛乳進(jìn)行加工的研究可以追溯到19世紀(jì)末期。近30年來(lái),隨著用于食品的超高壓設(shè)備研制和人們對(duì)天然高品質(zhì)牛乳的需求,超高壓技術(shù)已引起越來(lái)越多人的興趣。通過(guò)改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的氫鍵、離子對(duì)、疏水相互作用及靜電相互作用等,超高壓可對(duì)其功能性質(zhì)產(chǎn)生特殊影響,其影響的大小與蛋白的結(jié)構(gòu)、壓力的大小、蛋白的濃度、處理溫度與時(shí)間、pH、離子強(qiáng)度和溶劑組成等有關(guān)[3,18]。
López-Fandi?o等研究發(fā)現(xiàn),在25℃下,采用100MPa以上的高壓處理牛乳,其中的β-Lg的變性程度隨著壓力的升高而迅速增大,而α-La和BSA則對(duì)400MPa以下的壓力具有較高的抵抗性[17]。Huppertz等進(jìn)一步采用600MPa的壓力處理不同比例的牛奶與乳清混合物30~60min,其中僅有15%~33%的α-La發(fā)生了變性[11]。在高壓條件下,α-La的穩(wěn)定性明顯高于β-Lg,這很可能是因?yàn)閮烧咴诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異所致,α-La分子不含游離的巰基(S-H),而在β-Lg分子結(jié)構(gòu)中存在一個(gè)游離S-H,在高壓誘導(dǎo)的聚合中它可通過(guò)分子間S-H與S-S之間的交換反應(yīng)發(fā)揮重要作用[8]。實(shí)際上,如果在高壓處理之前向牛乳中添加一定量的巰基阻滯劑,如N-乙基馬來(lái)酰亞胺,可有效抑制α-La和β-Lg變性的發(fā)生[11]。
Kanno等研究0.1~1000MPa壓力下乳清分離蛋白溶液(pH6.8)在570nm波長(zhǎng)的濁度變化,發(fā)現(xiàn)在1%(w/v)的低濃度條件下,400MPa的高壓處理也會(huì)造成蛋白的變性(濁度增加),且隨著壓力和蛋白濃度的增加,其變性程度顯著提高。當(dāng)?shù)鞍诐舛仍鲋?0%,壓力達(dá)到600MPa時(shí),凝膠開(kāi)始形成[14]。
超高壓誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性還與溫度和處理時(shí)間密切相關(guān)。在一定壓力下,若延長(zhǎng)壓力處理時(shí)間,則β-Lg變性程度顯著增大,并且升高溫度也可增大其變性程度。Kleber等研究發(fā)現(xiàn),在25℃下,采用600MPa的壓力分別對(duì)0.75%(w/w)的乳清分離蛋白溶液、0.8%(w/w)的甜乳清和3.5%(w/w)的脫脂牛乳處理10min,其中的β-Lg的變性程度分別為50%、81%和94%,延長(zhǎng)壓力處理時(shí)間至30min,β-Lg的變性程度有了顯著提高,分別達(dá)到了58%、98%和98%。若將溫度升至40℃,脫脂牛乳中β-Lg變性程度幾乎達(dá)到100%,繼續(xù)升溫至60℃,乳清分離蛋白溶液和甜乳清中β-Lg變性程度均超過(guò)87%[23]。
超高壓處理牛乳中β-Lg的變性程度還與溶液的pH有關(guān)。在堿性pH條件下超高壓處理的牛乳中β-Lg的變性程度顯著高于酸性條件下的,這主要是因?yàn)樵趬A性環(huán)境下S-H的反應(yīng)活性較強(qiáng)[1,12]。Belloque等采用超高壓處理β-Lg溶液研究其構(gòu)象在不同的溫度和pH條件的伸展和復(fù)性時(shí)發(fā)現(xiàn),天然β-Lg的構(gòu)象隨著壓力的升高而逐漸伸展,在pH2.5的酸性條件下,其達(dá)到同樣伸展程度所需的壓力與pH6.8相比要高得多,且在壓力釋放之后,其蛋白構(gòu)象恢復(fù)的速度也較快[2]。
與α-La和β-Lg相比較,超高壓對(duì)乳清蛋白中其它構(gòu)成蛋白影響的研究相對(duì)較少。López-Fandi?o等研究發(fā)現(xiàn),在100~400MPa的壓力處理下,BSA幾乎沒(méi)有發(fā)生任何變性。BSA的極高耐壓性很可能與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān),在BSA內(nèi)存在著17個(gè)分子內(nèi)二硫鍵,但不存在游離S-H,這使得它具有更嚴(yán)密的分子結(jié)構(gòu),不容易受到壓力的影響[17]。
1.2 超高壓對(duì)酶活性的影響
自1946年Eyring開(kāi)始研究壓力對(duì)酶催化活性的影響以來(lái),高壓對(duì)酶活的作用機(jī)制一直未被解明。1981年,Morild提出超高壓對(duì)酶的催化活性的影響主要是通過(guò)對(duì)酶蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響來(lái)實(shí)現(xiàn)的。酶活性中心的基礎(chǔ)是其蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu),超高壓處理在導(dǎo)致酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)崩潰時(shí),酶活性中心的氨基酸組成也會(huì)相應(yīng)發(fā)生改變而喪失其活性中心,進(jìn)而改變其催化活性。一般來(lái)說(shuō),較低壓力下酶活的上升被認(rèn)為是壓力導(dǎo)致的凝聚促進(jìn)了酶與底物相接觸,從而加速了酶促反應(yīng)進(jìn)程[20]。
高壓可增強(qiáng)α-胰凝乳蛋白酶(α-Chymotrypsin)的催化活性和穩(wěn)定性。Mozhaev等研究發(fā)現(xiàn),在50℃,360MPa的條件下,α-Chymotrypsin表現(xiàn)出的催化活性是常壓下20℃時(shí)的30倍;當(dāng)壓力進(jìn)一步增大超過(guò)360MPa,其酶活性因?yàn)閴毫φT導(dǎo)的酶蛋白變性而降低。在常壓55℃條件下,α-Chymotrypsin會(huì)瞬間失去活性,當(dāng)壓力升至180MPa后,α-Chymotrypsin卻能在幾十分鐘內(nèi)保留其水解能力。如添加40%(v/v)丙三醇與該酶混合,可進(jìn)一步增強(qiáng)其穩(wěn)定性。當(dāng)溫度和壓力條件均處于酶活的臨界值時(shí),丙三醇的保護(hù)效應(yīng)尤顯突出。在55℃,470MPa條件下,40%(v/v)丙三醇中α-Chymotrypsin的酶活性是同一環(huán)境下水溶液中的七倍[21]。此外,Seyderhelm等研究發(fā)現(xiàn),在Tris緩沖液(pH7.0)中,果膠酯酶(pectinesterase)在45℃,600MPa高壓下處理10min,其酶活性?xún)H為常壓的68%,而將其溶入30%(w/v)蔗糖溶液中進(jìn)行同樣的高壓處理后,其酶活性為常壓的81%[34]。
不僅丙三醇和糖類(lèi)可有效增強(qiáng)酶的耐壓性,高濃度的蛋白對(duì)酶活性也表現(xiàn)出一定的保護(hù)效應(yīng)。Okamoto等研究表明,在純?chǔ)?Lg溶液中,嗜熱菌蛋白酶(Thermolysin)對(duì)β-Lg的有效水解壓力為150MPa,而在乳清溶液中,Thermolysin對(duì)其中的β-Lg的有效水解壓力則可增至200MPa[24]。類(lèi)似現(xiàn)象也出現(xiàn)在Maynard等的研究中,在不添加底物的條件下對(duì)胰蛋白酶(Trypsin)進(jìn)行100MPa的高壓處理,Trypsin的活性較初始活性損失了60%,進(jìn)一步加大壓力,Trypsin幾乎完全失去其活性,而當(dāng)?shù)孜铮é?Lg,50mg/mL-1)存在時(shí),Trypsin在300MPa的壓力處理15min后仍然有94%~98%的酶活力保留。這說(shuō)明高濃度蛋白對(duì)蛋白酶及其催化反應(yīng)可能具有保護(hù)效應(yīng)[19]。
1.3 超高壓對(duì)酶反應(yīng)體系pH的影響
酶解反應(yīng)的發(fā)生一般都需要在一定的溫度和pH條件下才能進(jìn)行,對(duì)于一些蛋白酶而言,壓力導(dǎo)致溶液的pH變化將影響酶解反應(yīng)的順利進(jìn)行。
Neuman等研究發(fā)現(xiàn),超高壓處理能夠降低一些酸的電離常數(shù)pKa,即可降低這類(lèi)酸溶液以及由這些酸形成的緩沖液的pH,其中以負(fù)電荷酸(如H2PO4-)最為明顯,pH變化較小的是中性酸(如檸檬酸),但對(duì)于單正電荷酸(如Tris陽(yáng)離子)則幾乎沒(méi)有影響[22]。Stapelfeldt等研究發(fā)現(xiàn),在30℃的常壓下,Trypsin(磷酸鹽緩沖液,pH8.0)和Thermolysin(Tris-HCl緩沖液,pH7.0)在自身最適pH條件下幾乎以相同的速率水解β-Lg,且在較低的壓力處理下,Trypsin和Thermolysin也能夠在30℃,30min內(nèi)顯著地消化天然的β-Lg;而當(dāng)壓力大于150MPa時(shí),Trypsin對(duì)β-Lg的消化程度明顯降低,而Thermolysin幾乎仍能完全消化β-Lg,這一消化率的差異很可能是由于在較高壓力作用下磷酸鹽緩沖液的pH逐漸降低,偏離了Trypsin最適的pH,而Tris-HCl緩沖液仍能維持pH在Thermolysin的最適范圍內(nèi)[36]。
1.4 超高壓對(duì)乳清蛋白水解進(jìn)程的影響
蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜,主要由包括一級(jí)結(jié)構(gòu)(即氨基酸序列)在內(nèi)的蛋白鏈之間的相互作用及與周?chē)軇┑南嗷プ饔脕?lái)維持。改變外部因素,如壓力或溫度,可以打破蛋白質(zhì)分子內(nèi)原有的平衡和蛋白質(zhì)與溶劑之間的相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)中多肽鏈的伸展或變性,進(jìn)而有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行。超高壓對(duì)蛋白質(zhì)水解進(jìn)程的影響主要是由于壓力可導(dǎo)致蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化,使其伸展暴露出更多的酶切位點(diǎn),不僅可用于水解溫和條件下難以被酶水解的蛋白,還可提高蛋白的水解進(jìn)程。
在一定壓力范圍內(nèi),天然蛋白質(zhì)的變性是一種可逆的變性。牛乳乳清蛋白混合物中的每一種蛋白(Sn;n=1,2,…,n)都處于天然蛋白(Sn,N)和變性蛋白(Sn,D)的某種動(dòng)態(tài)平衡中:Sn,N?Sn,D,其平衡系數(shù)Kn=[Sn,D]/[Sn,N]。如果混合物中的蛋白酶(EN,變性形式為ED)也處于這種動(dòng)態(tài)平衡中,EN對(duì)Sn,D的切割則較為容易。不同蛋白酶En對(duì)蛋白的消化程度因其平衡系數(shù)Kn的不同而不同。一定壓力下,若K1為所有平衡系數(shù)Kn中最大值,蛋白S1,D就往往最容易被蛋白酶EN水解為多肽或氨基酸[24]。Hayashi等發(fā)現(xiàn),在常壓下水解3h Thermolysin只能部分水解β-Lg,但SDS-PAGE分析表明,在200MPa高壓下水解3h,β-Lg則完全被水解掉,而α-La沒(méi)有發(fā)生變化[9]。Okamoto等進(jìn)一步研究也發(fā)現(xiàn),在200MPa的壓力范圍內(nèi),Thermolysin對(duì)牛乳清蛋白中β-Lg的水解程度隨著壓力的升高而增強(qiáng),而α-La幾乎沒(méi)有變化。這主要是因?yàn)棣?Lg對(duì)壓力和溫度的敏感性要高于α-La,其平衡系數(shù)K最大,因而在同等條件下蛋白酶總是優(yōu)先地消化β-Lg,而不是α-La[24]。
在常壓下,胃蛋白酶(Pepsin)在其最適pH范圍也幾乎不能水解β-Lg[32-33],而當(dāng)壓力從150MPa增加至300MPa時(shí),Pepsin對(duì)β-Lg的消化程度明顯增強(qiáng)[6]。Stapelfeldt等研究比較了三種不同的蛋白酶Pepsin、Thermolysin和Trypsin在30min,0.1~300MPa高壓下對(duì)β-LgB的水解情況,當(dāng)壓力從0.1MPa升至200MPa時(shí),三種蛋白酶對(duì)β-LgB的消化率也分別從0%、12%和18%增加至40%、95%和90%,進(jìn)一步增加壓力至300MPa,Pepsin對(duì)β-LgB的消化率可提高至90%左右。這表明一定壓力范圍內(nèi)隨著壓力的增加,乳清蛋白的水解進(jìn)程也顯著提高。壓力的作用主要在于使β-LgB的構(gòu)象發(fā)生改變,而不是對(duì)酶或酶與β-LgB反應(yīng)的直接作用[36]。
超高壓對(duì)乳清蛋白水解進(jìn)程的影響還與蛋白酶的種類(lèi)有關(guān)。Pen?s等采用0.1~300MPa的不同壓力研究了37℃,15min下三種蛋白酶Trypsin、Chymotrypsin、Pepsin對(duì)牛乳清蛋白水解產(chǎn)物致敏性影響時(shí)發(fā)現(xiàn),壓力的存在顯著促進(jìn)了三種酶對(duì)乳清蛋白的水解,且因酶種類(lèi)的不同其達(dá)到自身對(duì)乳清蛋白最大程度水解所需的壓力也表現(xiàn)出較大的差異:Chymotrypsin和Trypsin分別在100MPa和200MPa高壓下即可實(shí)現(xiàn)自身對(duì)乳清蛋白的最大水解,而Pepsin則需要更高的壓力[25]。進(jìn)一步采用4種食品級(jí)蛋白酶Alcalase、Neutrase、Corolase 7089和Corolase PN-L研究超高壓處理下牛乳清蛋白的水解情況,Pen?s等還發(fā)現(xiàn)水解反應(yīng)不論是發(fā)生在高壓處理中還是高壓處理后,均可顯著促進(jìn)蛋白酶對(duì)牛乳清蛋白的水解,并且高壓處理中進(jìn)行水解反應(yīng)更有利于各蛋白酶對(duì)牛乳清蛋白的水解[27]。
水解產(chǎn)物的功能特性主要是由多肽的分子量大小及其性質(zhì)決定的。利用酶解技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改性,可擴(kuò)大蛋白的功能特性及生物活性的應(yīng)用范圍[7]。在200MPa及以上的高壓條件下,蛋白的構(gòu)象變得更加伸展,暴露出更多的酶切位點(diǎn),有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行,同時(shí)也可改變產(chǎn)物的功能特性,提高其生物活性。
蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性在食品工業(yè)尤其是蛋白飲料工業(yè)有著重要意義。Chicón等研究發(fā)現(xiàn),對(duì)pH5.0,濃度為5mg/mL的天然乳清分離蛋白溶液進(jìn)行25~95℃不同熱處理后,其熱穩(wěn)定性顯著降低,95℃時(shí)可溶性?xún)H為36%左右;但在400MPa高壓下經(jīng)Pepsin處理10min或30min后,其水解產(chǎn)物在25~95℃的溫度范圍均表現(xiàn)出了較高的熱穩(wěn)定性,其可溶性均在90%以上。這一特性在乳清蛋白強(qiáng)化的營(yíng)養(yǎng)品中是比較有利的,因?yàn)樗捎行П苊鉄崽幚韼?lái)的渾濁現(xiàn)象[4]。
在食品工業(yè)中,提高蛋白的水解進(jìn)程對(duì)于降低食品的致敏性、保持風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)、提高產(chǎn)品的功能特性具有重要意義[10]。Pen?s等采用五種食品級(jí)蛋白酶Alcalase、Neutrase、Corolase 7089、Corolase PN-L 和Papain比較研究常壓與高壓處理下牛乳清水解產(chǎn)物的抗原致敏性,發(fā)現(xiàn)兩種處理?xiàng)l件下的水解作用均顯著降低了乳清蛋白的致敏性,且高壓下水解產(chǎn)物的致敏性更低。Alcalase和Neutrase高壓處理中的水解產(chǎn)物幾乎沒(méi)有殘留的β-Lg源抗原性,而Papain的高壓水解產(chǎn)物中則不存在任何抗原性[26-27]。Chicón等研究也發(fā)現(xiàn),在高壓條件下Pepsin和Chymotrypsin均可迅速地水解乳清蛋白,產(chǎn)生大分子疏水性多肽,這些水解產(chǎn)物表現(xiàn)出較低的抗原性和Ig-E親和力[4]。因而,高壓處理協(xié)同合適的蛋白酶對(duì)牛乳清進(jìn)行水解,可有效消除水解產(chǎn)物的抗原性,用作低致敏性嬰兒配方食品的原配料。
乳化性是蛋白質(zhì)重要的物化特性之一,在食品工業(yè)生產(chǎn)中可以有效抑制聚結(jié)的發(fā)生。Kilara和Panyam研究常壓下高強(qiáng)度水解乳清蛋白制備低過(guò)敏原配方時(shí)發(fā)現(xiàn),隨著水解程度的增強(qiáng),對(duì)低過(guò)敏原配方的穩(wěn)定性起重要作用的蛋白乳化性卻顯著下降[15]。Chicón等研究比較了常壓與高壓處理中乳清蛋白水解產(chǎn)物的乳化活性后發(fā)現(xiàn),在pH7.0的條件下,經(jīng)400MPa高壓處理后,乳清蛋白Pepsin水解產(chǎn)物的乳化活性顯著增強(qiáng),但進(jìn)一步延長(zhǎng)水解時(shí)間至30min,其乳化活性反而降低,但仍顯著高于乳清蛋白的乳化活性值(EAI),這表明高壓能控制蛋白的水解程度進(jìn)而提高水解產(chǎn)物的乳化活性[4]。
超高壓技術(shù)在食品加工領(lǐng)域的作用已逐漸被人們所認(rèn)識(shí),并可能成為未來(lái)一種新型的食品加工方法。超高壓處理可顯著提高蛋白的水解進(jìn)程,改變其水解模式,除去天然蛋白中對(duì)人體營(yíng)養(yǎng)與健康不良的成分(如致敏性成分),并可改變水解產(chǎn)物的功能特性,產(chǎn)生一些新的生物活性短肽。目前超高壓技術(shù)對(duì)牛乳蛋白影響的研究主要集中在對(duì)其蛋白構(gòu)象和水解進(jìn)程的影響,而對(duì)其在超高壓處理下水解產(chǎn)物的功能特性和生物活性的研究還很不足,且有待進(jìn)一步深入。乳清蛋白是乳品工業(yè)中大量產(chǎn)生的副產(chǎn)物,利用超高壓技術(shù)探索提高乳清蛋白的附加值,研究加壓酶解后產(chǎn)物的功能特性,如抗氧化、抗腫瘤活性和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制活性等,具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。此外,它還可為乳清蛋白以外那些已被證實(shí)水解產(chǎn)物具有良好功能特性和生物活性的動(dòng)植物蛋白,如麥胚蛋白、油菜籽分離蛋白、沙丁魚(yú)副產(chǎn)物和豬血漿蛋白等的研究提供理論上的指導(dǎo)。
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Review of the study on bovine whey protein hydrolysis under high hydrostatic pressure
SHENG Xiao-bo,MU Tai-hua*
(Institute of Agro-Food Science and Technology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)
This paper reviewed mainly the research progress in the effects of high hydrostatic pressure on the hydrolysis of bovine whey protein and its functional properties in the national and international.In addition,the potential developments and the application on the bioactive peptides derived from the bovine whey protein hydrolysis under high hydrostatic pressure were also put forward.
high hydrostatic pressure;proteolysis;β-lactoglobulin;functional properties
TS252.1
A
1002-0306(2011)10-0462-05
2010-10-08 * 通訊聯(lián)系人
盛小波(1986-),男,在讀碩士研究生,研究方向:食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)。
河北省山區(qū)百萬(wàn)畝旱地雜糧技術(shù)創(chuàng)新與產(chǎn)業(yè)化示范(08230907Z-2)。