Th17/Treg細(xì)胞在慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制及臨床轉(zhuǎn)歸中的作用

殷杰 徐棟花 馮灝

HBV感染仍然是一種嚴(yán)重影響人類健康的全球性疾病，預(yù)后不良，可發(fā)展為慢性乙型肝炎（CHB）、肝硬化和原發(fā)性肝癌。HBV感染人體后，并不直接導(dǎo)致肝細(xì)胞病變，而是在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖，乙型肝炎相關(guān)抗原與宿主細(xì)胞膜或胞內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用，形成含有自身組織蛋白的抗原，導(dǎo)致肝細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，機(jī)體免疫系統(tǒng)被致敏，細(xì)胞免疫失去調(diào)控，體液免疫應(yīng)答亢進(jìn)，產(chǎn)生大量針對宿主自身組織的抗體，從而發(fā)生自身組織免疫反應(yīng)[1]。宿主在清除病毒的同時，也攻擊表面有病毒抗原的肝細(xì)胞，使其發(fā)生壞死，肝小葉的正常結(jié)構(gòu)被破壞，肝臟代謝功能降低，纖維母細(xì)胞增生并合成膠原纖維，逐漸發(fā)展經(jīng)肝纖維化為肝硬化，甚至肝癌，但其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確[2]。肝臟疾病的發(fā)生伴隨著Th17及Treg細(xì)胞的異常[3，38]，它們對病毒抗原的反應(yīng)狀態(tài)不同，在疾病臨床轉(zhuǎn)歸中的影響亦不同，為探討CHB的發(fā)病機(jī)制和防治措施提供了新的思路。

一、Th17細(xì)胞概況

（一）Th17細(xì)胞的發(fā)現(xiàn) 2000年，Infante D等在萊姆病人的炎癥關(guān)節(jié)處分離到一群高分泌IL-17而不分泌IL-4、IFN-γ的CD4+T細(xì)胞[4]。有關(guān)Thl7的突破性研究進(jìn)展則主要來源于對人類自身免疫性疾病小鼠模型實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎（EAE）、膠原誘導(dǎo)的自身免疫性關(guān)節(jié)炎（CIA）的研究。2005年，Park H在對EAE和CIA兩種自身免疫疾病動物模型的研究過程中發(fā)現(xiàn)了一類新的CD4+T細(xì)胞亞群—Th17細(xì)胞，它能特異性分泌IL-17[5]。

（二）Th17細(xì)胞的分化與調(diào)節(jié) Thl7細(xì)胞分化需要IL-6和TGF-β的聯(lián)合作用。Ivanov II[6]等首先發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞發(fā)育、分化依賴的特異性轉(zhuǎn)錄因子——孤兒受體RORγt，而GATA3、T-bet、Smad7在控制其轉(zhuǎn)錄過程中均無作用。RORγt表達(dá)于造血干細(xì)胞、未成熟的胸腺細(xì)胞及Thl7等細(xì)胞中，在分化成熟的Thl7細(xì)胞中高表達(dá)，可通過啟動染色體重塑機(jī)制開放IL-17的基因座位，使其他因子結(jié)合到IL-17的啟動子上，從而誘導(dǎo)IL-17A和IL-17F基因的表達(dá)。

TGF-β和IL-6或IL-21的協(xié)同作用是誘導(dǎo)Thl7細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素，TGF-β單獨作用時也可誘導(dǎo)FoxP3+的Treg細(xì)胞的表達(dá)，因此TGF-β在調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化過程中具有雙重作用，只有當(dāng)TGF-β與IL-6共同存在時才能啟動Thl7細(xì)胞的分化。Mangan PR等[7]發(fā)現(xiàn)，外源性TGF-β是促進(jìn)Th17細(xì)胞分化的主要因素；IL-6在促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞方向分化、抑制其分化為Treg的過程中起著重要作用[8]，當(dāng)體內(nèi)有炎性細(xì)胞因子IL-6存在時，F(xiàn)oxP3+T細(xì)胞的分化受到抑制，封閉IL-6的作用則促進(jìn)FoxP3+T細(xì)胞的發(fā)育。此外，Th17細(xì)胞與其分化增殖密切相關(guān)的細(xì)胞因子IL-23構(gòu)成一個IL-23/Th17軸，IL-23主要通過促進(jìn)Thl7細(xì)胞的增殖與存活，招募Thl7細(xì)胞向炎癥部位聚集[9]；IL-l和TNF-α 也具有促進(jìn) Thl7 細(xì)胞分化的作用[8，10]。研究發(fā)現(xiàn)[11，12]，細(xì)胞因子信號蛋白3（Socs3）可通過影響STAT3的磷酸化，負(fù)性調(diào)節(jié)Thl7細(xì)胞的分化；IL-6家族的新成員IL-27以STAT1依賴的方式抑制Th17細(xì)胞的分化，且這一抑制作用不依賴于IFN-γ和SOCS3。

（三）IL-17/Th17與肝纖維化之間的關(guān)系 IL-17亦稱為IL-17A，是IL-17家族（IL-17A～I(xiàn)L-17F）中的一個成員，Th17細(xì)胞通過分泌IL-17、IL-17F及IL-22，在某些抗感染免疫和誘導(dǎo)自身免疫性炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。IL-17受體（IL-17R）是一類獨特的細(xì)胞因子受體家族，目前發(fā)現(xiàn)有IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD和 IL-17RE，其中 IL-17RA和IL-17RC是IL-17和IL-17F的受體[13]。研究表明，IL-17是早期出現(xiàn)的促炎細(xì)胞因子，刺激人類成纖維細(xì)胞分泌IL-6、細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）、IL-8、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CFS）和前列腺素E2；優(yōu)先促進(jìn) CD34+造血干細(xì)胞成熟并分化為中性粒細(xì)胞[14，15]。用IL-17特異性單抗治療也能緩解CIA等自身免疫病的臨床癥狀[16]。

目前，絕大多數(shù)的研究者認(rèn)為，IL-17是一種致纖維化的細(xì)胞因子，參與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑，導(dǎo)致纖維化[17]；它可以上調(diào)小鼠心肌成纖維細(xì)胞的膠原蛋白的基因表達(dá)，還可以間接地通過誘導(dǎo)IL-6而促進(jìn)膠原聚集[15]；IL-17還參與TGF-β介導(dǎo)的器官移植后慢性排斥反應(yīng)中的纖維化過程[18]。TGF-β和IL-1β是非常關(guān)鍵的致纖維化因子，二者可通過上調(diào)IL-17的表達(dá)促進(jìn)纖維化的發(fā)[19]。IL-17在腎臟纖維化中也可能起重要作用，Zuber J等發(fā)現(xiàn)，在腎移植術(shù)后慢性排斥反應(yīng)的纖維化組織中觀察到IL-17陽性細(xì)胞的浸潤[20]。Zhang JY等研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血和肝細(xì)胞內(nèi)Th17細(xì)胞都有表達(dá)，并可能加劇慢性HBV感染的肝臟損傷[21]。研究發(fā)現(xiàn)，CHB的肝組織炎癥反應(yīng)使肝臟間質(zhì)細(xì)胞大量表達(dá)TGF-β，它與IL-6共同作用可啟動CD4+初始T淋巴細(xì)胞向Thl7細(xì)胞的迅速分化[22]。成熟的Thl7細(xì)胞能夠分泌IL-l7、IL-6等炎性介質(zhì)，IL-17又可誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β等炎性因子、趨化性細(xì)胞因子和金屬蛋白酶的表達(dá)，進(jìn)一步協(xié)同放大炎癥反應(yīng)，引起炎癥細(xì)胞浸潤和肝組織損傷[23]。

肝臟纖維化是肝臟疾病發(fā)展過程的一個階段，輕度可以逆轉(zhuǎn)，但當(dāng)不可逆性時，其轉(zhuǎn)化為肝癌的機(jī)率明顯上升。肝星狀細(xì)胞活化是肝纖維化形成的關(guān)鍵，可活化為肌成纖維細(xì)胞，通過旁分泌與自分泌作用的方式，合成并分泌多種ECM，同時釋放大量基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑，從而減少ECM的降解，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成大于降解，最終過量積聚在肝內(nèi)，造成肝臟纖維化。Lemmers A[24]等證實IL-17/Th17通路在酒精性肝炎患者疾病的進(jìn)展起到關(guān)鍵作用，IL-17在患者外周血中的水平明顯升高，肝組織中也出現(xiàn)大量Thl7細(xì)胞的浸潤，且疾病嚴(yán)重程度和肝臟纖維化的程度均與Thl7細(xì)胞浸潤程度成正比；此外，他們還發(fā)現(xiàn)在患者肝組織活檢中，肝星狀細(xì)胞表面有IL-17R的表達(dá)，患者肝組織周圍浸潤大量分泌lL-17炎性因子的細(xì)胞，推測其是造成中性粒細(xì)胞歸巢的主要因素。Rong G等[25]對膽汁性肝硬化病人、乙型肝炎病人及正常人外周血中的Thl7、Treg細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀和RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)Thl7相關(guān)因子在膽汁性肝硬化病人外周血升高顯著，而Treg細(xì)胞數(shù)量則下降。上述研究提示，IL-17與TGF-β、TNF-α、IL-6、IL-lβ等與肝纖維化相關(guān)的細(xì)胞因子之間存在著密切的生物學(xué)關(guān)系，推測IL-17/Th17可能在肝臟纖維化的發(fā)生中扮演重要的角色。

二、Treg細(xì)胞概況

（一）Treg細(xì)胞的發(fā)現(xiàn) 1995年，日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+T細(xì)胞回輸之后可以抑制裸鼠多種自身免疫疾病的發(fā)生，該細(xì)胞被命名為Treg細(xì)胞，其特征性標(biāo)志為FoxP3[26]。根據(jù)其來源，可分為天然Treg細(xì)胞（nTregs）和誘導(dǎo)性Treg細(xì)胞（iTregs）[27]。

（二）Treg細(xì)胞的分化與調(diào)節(jié) Treg的特征性高表達(dá)CD25、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（CTLA-4）、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型腫瘤壞死因子受體（GITR）[28]及低水平的CD-127（IL-7受體α鏈）[29]，F(xiàn)oxP3是其發(fā)育、分化及維持功能的關(guān)鍵調(diào)控基因。CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞約占正常人外周血CD4+T細(xì)胞的5%～10%，主要發(fā)揮免疫抑制功能，下調(diào)機(jī)體免疫應(yīng)答的水平以維持自身耐受。Laurence A等研究表明，IL-2在維持和促進(jìn)Th1、Th2、Treg細(xì)胞功能活性的同時，卻發(fā)揮著抑制Thl7細(xì)胞分化的作用[30]。

（三）Treg細(xì)胞與CHB的關(guān)系 CHB分為免疫耐受期、免疫激活期、免疫清除期三個不同的臨床階段。Treg在不同的臨床階段發(fā)揮的功能是有差異的，一方面，它能維持免疫穩(wěn)定，防止自身免疫性肝病的發(fā)生；另一方面，Treg抑制免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝炎病毒的慢性感染持續(xù)，在一定程度上促進(jìn)原發(fā)性肝癌的發(fā)生。在急性肝炎、暴發(fā)性肝炎或自身免疫性肝病早期，Treg的表達(dá)頻率較低，在恢復(fù)期頻率明顯增高，而在器官移植患者中Treg功能表現(xiàn)為促進(jìn)移植耐受，提示Treg與HBV感染所導(dǎo)致的免疫耐受相關(guān)[31]。Lan RY等在對自身免疫性肝病的研究中則發(fā)現(xiàn)患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少[32]；Ormandy LA等研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者外周血中CD4+CD25+Treg的頻率與健康對照組相比顯著上調(diào)，提示Treg細(xì)胞的變化與乙肝病毒相關(guān)性肝癌的進(jìn)展可能存在相關(guān)性[33]。國內(nèi)外研究中，關(guān)于CHB患者外周血及肝組織中CD4+CD25+Treg細(xì)胞的頻率及表型差異，報道并不一致，且對于CD4+CD25+Treg細(xì)胞在CHB發(fā)病機(jī)制中的免疫學(xué)作用及去除CD4+CD25+Treg細(xì)胞后是否能有效增強(qiáng)HBV抗原肽誘導(dǎo)的抗HBV免疫應(yīng)答尚不確定[34]。有報道提出[35]，Treg細(xì)胞在HBV感染的持續(xù)化過程中發(fā)揮重要作用，且CHB外周血中Treg細(xì)胞的頻率與血清中HBV DNA的含量存在正相關(guān)關(guān)系。還有研究發(fā)現(xiàn)，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的異常與乙型肝炎的慢性化及病毒清除存在密切關(guān)系，并與疾病進(jìn)展為肝硬化相關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確[34，36]。HBeAg被認(rèn)為是HBV感染的耐受原，參與誘導(dǎo)機(jī)體Treg細(xì)胞的分化，在鼠動物模型中，HBeAg能夠誘導(dǎo)其發(fā)生T細(xì)胞免疫耐受[37，38]。眾多研究報道的異質(zhì)性可能是研究對象處于CHB的不同臨床進(jìn)展階段或研究者對Treg細(xì)胞的人為標(biāo)記（表現(xiàn)為CD4+CD25+T、CD4+Foxp3+T、CD4+CD25+Foxp3+T等）不同造成的。

三、Th17/Treg細(xì)胞

（一）Th17與Treg細(xì)胞的關(guān)系 Romagnani S等證明[39]，Thl7和Treg細(xì)胞具有共同的起源，二者的分化均依賴TGF-β。在TGF-β單獨作用下，活化的初始CD4+T細(xì)胞分化為抗炎的Treg細(xì)胞；而在TGF-β和IL-6共同作用下，活化的初始CD4+T細(xì)胞分化為促炎的Thl7細(xì)胞，IL-6在其中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。有報道稱[40]，低濃度的TGF-β可以引起RORγt的表達(dá)，高濃度的TGF-β卻抑制RORγt的表達(dá)和功能，并利于Treg細(xì)胞的產(chǎn)生。因此，促炎性Th17細(xì)胞與抑炎性Treg細(xì)胞之間平衡狀態(tài)的打破可能是很多炎癥性疾病及自身免疫性疾病發(fā)生的是一個關(guān)鍵因素。

（二）Th17/Treg細(xì)胞在CHB發(fā)病中的作用 在CHB患者體內(nèi)，抗病毒的免疫功能低下或免疫耐受，主要表現(xiàn)為DC功能的低下、CD8+T細(xì)胞對HBV抗原的耐受、CD4+T細(xì)胞功能缺陷等[41]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血及肝組織中Th17/Treg 細(xì)胞的頻率異常[25，33，42，43]。Th17 細(xì)胞的肝內(nèi)聚集可能加重肝臟組織炎癥損傷，參與肝炎-肝硬化-肝癌的發(fā)生；而Treg細(xì)胞能夠抑制HBV特異的CD4+T、CD8+T細(xì)胞的增殖及IFN-γ的分泌，且Treg細(xì)胞頻率與病人血清中HBV-DNA的數(shù)量相關(guān)，提示CHB慢性進(jìn)展的不同臨床階段，患者肝組織及外周血中Treg與Th17的頻率不一、比率不同、表型及功能特征的差異可能與乙型肝炎的發(fā)病、臨床轉(zhuǎn)歸及CHB患者血清中的病毒載量有關(guān)。Zhang等[38]應(yīng)用恩替卡韋抗病毒藥物治療CHB患者時發(fā)現(xiàn)，隨著血清中HBV DNA載量的減少，外周血Th17細(xì)胞頻率升高，而Treg細(xì)胞頻率則減低，導(dǎo)致Treg/Th17比率明顯降低；同時發(fā)現(xiàn)，隨著抗病毒治療、病毒復(fù)制的減少，患者外周血單個核細(xì)胞（PBMC）在HBcAg的刺激作用下，IL-17的分泌呈下降趨勢。提示我們，Treg和ThI7細(xì)胞的功能失衡可能是CHB抗病毒治療過程中感染持續(xù)的重要原因。研究CHB患者外周血中Thl7細(xì)胞與Treg細(xì)胞之間的相互關(guān)系，對于治療CHB及判斷CHB預(yù)后等臨床難題的意義重大。

四、展望

在CHB的發(fā)生及臨床進(jìn)展過程中，Th17/Treg發(fā)揮重要的作用。目前，對Th17、Treg細(xì)胞的研究主要集中在動物模型及人外周血水平上，缺乏人體肝臟組織內(nèi)的相關(guān)研究，特別是關(guān)于Treg和Th17細(xì)胞的功能失衡及相互關(guān)系在CHB的發(fā)病機(jī)制及臨床轉(zhuǎn)歸中的影響。另外，通過調(diào)控Th17與Treg細(xì)胞的平衡對CHB進(jìn)行治療的策略也值得進(jìn)一步探究。

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