蛋白質(zhì)降解及其產(chǎn)物氨基酸檢測(cè)的研究進(jìn)展

孫秋君，陳曉曄，朱建良

(南京工業(yè)大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，江蘇南京210009)

蛋白質(zhì)降解及其產(chǎn)物氨基酸檢測(cè)的研究進(jìn)展

孫秋君，陳曉曄，朱建良

(南京工業(yè)大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，江蘇南京210009)

綜述了蛋白質(zhì)的降解方法，包括酸水解、堿水解、酶解以及超聲輔助水解，并分析比較了每種方法的優(yōu)缺點(diǎn)。其次從檢測(cè)方法的角度綜述了蛋白降解產(chǎn)物-氨基酸的分析檢測(cè)方法，包括化學(xué)分析法、電化學(xué)分析法和分光光度法。

蛋白質(zhì)，降解，氨基酸，檢測(cè)

氨基酸營(yíng)養(yǎng)已成為蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)研究的熱點(diǎn)之一，氨基酸作為蛋白質(zhì)消化的主要產(chǎn)物，在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝中起重要作用。與蛋白質(zhì)的吸收相比具有吸收速度快、耗能低、不易飽和等特點(diǎn)。從20世紀(jì)初氨基酸工業(yè)化生產(chǎn)以來(lái)，氨基酸生產(chǎn)主要有蛋白水解法、發(fā)酵法和有機(jī)合成法，在實(shí)際應(yīng)用中，主要是用蛋白質(zhì)水解法制備氨基酸。因?yàn)榘被崾堑鞍踪|(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，各種蛋白質(zhì)都含有20余種氨基酸，蛋白質(zhì)由大量氨基酸通過(guò)肽鍵連接為大分子的物質(zhì)，它們都帶有不同的側(cè)鏈。水解的目的就是使蛋白質(zhì)中肽鏈斷裂，生成自由的氨基酸。因此水解法是最簡(jiǎn)單最容易的制備方法［1］。

1 蛋白質(zhì)的降解方法

1.1 酸水解

蛋白質(zhì)的酸水解是在高溫條件下用無(wú)機(jī)酸催化進(jìn)行，常用的無(wú)機(jī)酸是鹽酸、硫酸和甲基磺酸等［2］，其中，鹽酸是最通用的水解劑，它既可以應(yīng)用于液相的水解模式，也可以應(yīng)用于氣相的水解模式，水解過(guò)后容易蒸發(fā)除去，水解產(chǎn)物可以濃縮，并且只要很少的緩沖溶液就可以溶解。用鹽酸水解時(shí)通常濃度為6mol/L［1］。嚴(yán)群芳［3］等人利用HCl水解大豆蛋白獲得游離氨基酸，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了酸濃度為6mol/L，水解時(shí)間14h，液固比為4∶1的最佳水解條件，使得氨基酸的產(chǎn)量達(dá)到55.74%。何強(qiáng)飛［4］等人采用25% HCl在溫度為90℃的條件下，水解大米飼料蛋白20h，其水解率可達(dá)到52.85%。路亮［5］等人采用8N HCl對(duì)制革下腳料進(jìn)行降解以獲得混合氨基酸。其中，原料重∶酸用量=1∶1.2w/v，在105～110℃下水解11h，經(jīng)脫酸、脫色、中和、濃縮、結(jié)晶得到氨基酸總量為35.54%。得到人體必需氨基酸為11.58%的混合氨基酸。孔薇［6］、王亞林［7］分別用鹽酸對(duì)大豆餅粕和毛發(fā)進(jìn)行降解，得到了相應(yīng)的氨基酸。

另外，硫酸也是常用的酸水解劑。徐彭［8］等人采用硫酸水解法水解蠶蛹蛋白，得到氨基酸態(tài)氮分別為9.05%和13.45%的食用復(fù)合氨基酸粉和精制復(fù)合氨基酸粉。張寒俊［9］等人以雙低油菜籽脫脂粕為原料，采用硫酸水解法制備天然復(fù)合氨基酸粉，確定最佳工藝參數(shù)為水解溫度 130℃，時(shí)間2h，酸濃度6mol/L，液固比3∶1，此條件下產(chǎn)品得率為38.70%。王家宏［10］等人采用5mol/L的硫酸水解羽毛蛋白，工藝條件為水解時(shí)間8h，水解溫度120℃，無(wú)機(jī)鹽催化劑用量40g/kg，最終得到的水解液中含有17種氨基酸。

酸水解法水解迅速而徹底，無(wú)消旋作用。但是會(huì)產(chǎn)生大量的廢酸污染環(huán)境。而酸劑的濃度、用量、水解時(shí)間、溫度等都對(duì)蛋白質(zhì)的水解有一定的影響。

1.2 堿水解

堿水解法通常以氫氧化鈉作為水解劑。趙芯［11］等人采用氫氧化鈉水解微生物蛋白得到氨基酸，在最佳水解條件下，即水解溫度90℃、反應(yīng)時(shí)間2h、氫氧化鈉溶液濃度30%、液固比50∶1的條件下，氨基酸產(chǎn)生量可達(dá)39.9mg/g干菌體。韓揚(yáng)［12］等人以燕麥麩皮為原料，通過(guò)堿提工藝提取燕麥麩皮蛋白。在料液比為1∶20，反應(yīng)時(shí)間為2h，溶液含堿量為1.0mol/L的條件下，蛋白質(zhì)的水解度達(dá)到30%左右。李遠(yuǎn)坤［13］以大麥麩皮作為原料，首先采用堿提酸沉法提取大麥麩皮中10%的蛋白質(zhì)，隨后利用堿解法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，蛋白的水解度在30%左右。水解產(chǎn)物主要是對(duì)應(yīng)分子量分別在31500u和100～200u左右的小分子物質(zhì)。尹國(guó)強(qiáng)［14］等人先采用亞硫酸氫鈉溶液對(duì)羽毛進(jìn)行預(yù)處理，以縮短水解時(shí)間，隨后用0.4%的氫氧化鈉溶液水解已處理的羽毛粉，液固比為15∶1，反應(yīng)溫度為90℃，反應(yīng)時(shí)間2h，在此條件下制得羽毛蛋白的降解率為65.7%。

堿水解法水解迅速?gòu)氐?，蛋白質(zhì)分子中的大部分氨基酸都要遭受破壞，但是色氨酸不被破壞，并且產(chǎn)生消旋作用，對(duì)設(shè)備的腐蝕性大，所以工業(yè)上多不采用此方法。

1.3 酶解法

蛋白質(zhì)原料在一定的pH和溫度條件下經(jīng)蛋白水解酶作用分解成氨基酸和小肽的過(guò)程稱為酶水解法。在用酶法對(duì)蛋白質(zhì)水解時(shí)所用的酶為蛋白酶，從來(lái)源上可以分為動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶。

動(dòng)物蛋白酶中，胰蛋白酶和胃蛋白酶的酶解效果較好，但價(jià)格有些高。徐娟［15］等人選用胃蛋白酶對(duì)綠豆分離蛋白進(jìn)行酶法水解，在沸水浴中90℃處理20min，在37℃、pH1.8、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%、酶量6000U/g條件下酶解180min，水解度為19.86%。盛家榮［16］等人利用胃蛋白酶水解板藍(lán)根多糖中的蛋白質(zhì)，通過(guò)考察pH，胃蛋白酶用量，反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間4個(gè)因素確定去除蛋白的最佳工藝，使得水解液中多糖的含量達(dá)到87.7%。姜莉［17］等人利用胰蛋白酶水解核桃蛋白，在反應(yīng)時(shí)間4.0h、底物質(zhì)量濃度27g/L、溫度53.4℃、pH8.0、加酶量(E/S)8.3g/kg的條件下，水解度可達(dá)14.497%。

在植物蛋白酶中，以木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶應(yīng)用較多，但反應(yīng)周期較長(zhǎng)，水解效率低，易受外界影響。陳彥平［18］、左繼紅［19］、王辰［20］等人以木瓜蛋白酶分別對(duì)玉米胚芽蛋白、大豆蛋白和螺旋藻蛋白進(jìn)行水解，都得到了較高的水解率。

微生物蛋白酶活性較高，用于酶解法的主要有中性蛋白酶和堿性蛋白酶。劉新華［21］等人利用堿性蛋白酶水解玉米蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在pH10.5、酶解溫度60℃、酶與底物比5%、底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的條件下酶解4h，可使水解度和氮溶解指數(shù)分別達(dá)到49.7%和51.2%。車(chē)有榮［22］利用中性蛋白酶對(duì)花生粕蛋白進(jìn)行降解，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:花生粕水解產(chǎn)物的氨基酸組成完全，且人體所必需的8種氨基酸含量較高。

靳挺［23］采用復(fù)合酶(Alcalase堿性內(nèi)切蛋白酶和Flavourzyme風(fēng)味蛋白酶)水解魷魚(yú)蛋白，結(jié)果表明，F(xiàn)lavourzyme能有效提高魷魚(yú)蛋白的水解度，在優(yōu)化的水解條件下，魷魚(yú)蛋白水解度達(dá)20.11%，水解產(chǎn)物的平均分子量為1180u，約由9.2個(gè)氨基酸殘基組成。水解產(chǎn)物中必需氨基酸含量占氨基酸總量的38.4%，天冬氨酸和谷氨酸等鮮味氨基酸占氨基酸總量的26.3%。

酶水解法的優(yōu)點(diǎn)為反應(yīng)條件溫和，無(wú)消旋作用。但是，酶解法水解不徹底，產(chǎn)物中除氨基酸外，含有較多的肽類(lèi)。

1.4 微波輔助水解法

微波是一種高頻電磁波，微波能夠透射到生物組織內(nèi)部使偶極分子和蛋白質(zhì)的極性側(cè)鏈以極高的頻率振蕩，引起分子的電磁振蕩等作用，增加分子的運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致熱量的產(chǎn)生。微波的能量可以大大縮短完全水解的時(shí)間。

微波輔助水解法在酸解、酶水解方面都有著一定的應(yīng)用［24］。Zhong Hong-ying等［25］用6mol/L HCl處理細(xì)胞色素C等蛋白質(zhì)，在微波輻射下水解30～90s，得到專(zhuān)一的多肽。Lin Hua等［26］用2%甲酸水解肌球素將牛血清白蛋白降解成多肽，而且不需要凈化就可以進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。

蛋白質(zhì)酶促水解反應(yīng)是制備生物活性多肽的一種有效方法。微波輻射水解的效率都高于常規(guī)酶水解，這是因?yàn)槌Ｒ?guī)方法所需時(shí)間長(zhǎng)、升溫慢，這些都會(huì)導(dǎo)致酶失活;而微波加熱可以在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到很高溫度，在酶徹底失活之前就完成水解反應(yīng)。Juan Hsueh-fen等［27］對(duì)蛋白質(zhì)凝膠水解進(jìn)行研究，經(jīng)凝膠處理的五種蛋白質(zhì)分別在常溫下反應(yīng)16h及195W微波輻射5min，隨后進(jìn)行二維電泳及質(zhì)譜分析，結(jié)果表明微波方法優(yōu)于常規(guī)方法。Vesper H W等［28］在不同溫度、緩沖溶液濃度和水解時(shí)間條件下，對(duì)胰蛋白酶及蛋白內(nèi)切酶催化水解進(jìn)行了全面的研究，胰島素在50℃，20min的水解效率比常規(guī)方法高20%，蛋白內(nèi)切酶穩(wěn)定性隨著溫度提高而下降，導(dǎo)致其水解效率降低。

2 氨基酸的檢測(cè)方法

蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)降解得到氨基酸，其種類(lèi)以及含量便成為人們研究和關(guān)注的熱點(diǎn)。

1985年Spackman［29］等首次報(bào)道了氨基酸自動(dòng)分析方法，經(jīng)過(guò)50多年的發(fā)展，氨基酸分析方法得到不斷的改進(jìn)和完善，由最初的陽(yáng)離子交換色譜分離-柱后茚三酮衍生化方法發(fā)展為多種分析方法并存，互相取長(zhǎng)補(bǔ)短［30］。氨基酸分析，按分離方法可分為紙色譜法、離子交換色譜法、反相高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、氣相色譜法等;按檢測(cè)方法分可分為化學(xué)分析法、電化學(xué)方法(包括電導(dǎo)檢測(cè)、安培檢測(cè))、分光光度法(包括可見(jiàn)光分光光度法、紫外光分光光度法和熒光分光光度法)等;按衍生反應(yīng)的先后可分為柱前衍生和柱后衍生法。氨基酸是一類(lèi)化學(xué)性質(zhì)相似的生物活性物質(zhì)，在分析過(guò)程中，檢測(cè)方法的靈敏度對(duì)分析的準(zhǔn)確性起非常重要的作用［31］。

2.1 化學(xué)分析法

2.1.1 甲醛滴定法 甲醛滴定法［32］用于氨基氮的測(cè)定，可以測(cè)出樣品中總氨基酸的含量，但是該法準(zhǔn)度差，終點(diǎn)較難掌握。徐勤［33］采用甲醛法測(cè)定大豆蛋白的水解度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甲醛法測(cè)得的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。姚玉靜［34］對(duì)比了甲醛滴定法和pH-stat法對(duì)大豆蛋白水解度測(cè)定的差異。結(jié)果表明，采用內(nèi)切蛋白酶對(duì)蛋白進(jìn)行水解時(shí)，pH-stat法和甲醛測(cè)定結(jié)果較為接近;而采用富含外肽酶的蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解時(shí)，采用pH-stat法測(cè)定水解度會(huì)導(dǎo)致水解度偏低。

2.1.2 凱氏定氮法 凱氏定氮法［35］是用于測(cè)定樣品中總氮的含量，然后根據(jù)蛋白質(zhì)和氨基酸中的氮含量，從而得知含氮的氨基酸、蛋白質(zhì)的總量，該方法準(zhǔn)確度高，但是操作步驟復(fù)雜、試劑耗量多、測(cè)定周期長(zhǎng)。

2.2 電化學(xué)分析法

采用適用于不同氨基酸的選擇電極，可對(duì)各種氨基酸進(jìn)行測(cè)定［36］，電導(dǎo)檢測(cè)和安培檢測(cè)的方法，也被人們廣泛應(yīng)用于氨基酸的分析［37-38］。電化學(xué)分析的最大優(yōu)點(diǎn)在于無(wú)需衍生反應(yīng)，操作簡(jiǎn)便，它與各種現(xiàn)代化的分離方法相結(jié)合可以大大簡(jiǎn)化操作過(guò)程，節(jié)約分析時(shí)間。

2.3 分光光度法

大多數(shù)氨基酸對(duì)紫外和可見(jiàn)光的吸收很弱或無(wú)吸收，所以通常利用氨基酸分子中的氨基、羥基或其它活性基團(tuán)與衍生化試劑反應(yīng)，生成具有可見(jiàn)光、紫外生色團(tuán)或能產(chǎn)生熒光的衍生反應(yīng)產(chǎn)物，然后用可見(jiàn)光、紫外或熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)［24］。

2.3.1 可見(jiàn)光檢測(cè) 通常能使氨基酸在可見(jiàn)光區(qū)有吸收的衍生試劑有茚三酮、磺酰氯二甲胺偶氮苯(DABSYL-Cl)等。氨基酸與茚三酮經(jīng)加熱反應(yīng)后，一級(jí)胺與之生成藍(lán)紫色化合物，二級(jí)胺與之生成黃色化合物。兩種衍生物檢測(cè)波長(zhǎng)分別為570nm和436nm［38］。邵金良［39］利用茚三酮法檢測(cè)茶葉中游離氨基酸的總量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pH8.0、沸水浴加熱15min、冷卻10min后在最大吸收波長(zhǎng)570nm處測(cè)定，該方法的變異系數(shù)小于1.69%，加標(biāo)平均回收率為96.33%。周?chē)?guó)蘭［40］以2%的茚三酮溶液作為顯色劑，pH8.0的磷酸鹽作為緩沖溶液，在570nm處測(cè)得茶葉中游離氨基酸的含量。茚三酮衍生顯色反應(yīng)的靈敏度可達(dá)2×10-10～5×10-10mol/L，衍生物穩(wěn)定性較好。其缺點(diǎn)是衍生反應(yīng)條件較高，需附加溫衍生裝置，體系平衡時(shí)間長(zhǎng)［41］。

2.3.2 紫外光檢測(cè) 紫外光檢測(cè)，是通過(guò)氨基酸與衍生試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成的氨基酸衍生物在紫外光光譜范圍內(nèi)有吸光度值。通常使用的衍生試劑包括鄰苯二甲醛(OPA)［26］、異硫氰酸苯酯(PITC)、6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯［24］。

2.3.2.1 鄰苯二甲醛(OPA)法 OPA作為衍生試劑，雖然衍生反應(yīng)非常快速，但有較強(qiáng)的選擇性，只能用于一級(jí)氨基酸的衍生，且衍生物的穩(wěn)定性較差。劉春蘭［42］利用鄰苯二甲醛(OPA)-柱前衍生反相高效液相色譜法測(cè)定了海洋膠體重的氨基酸組成和含量，檢出限為2×10-3～9×10-3μmol/L，相對(duì)偏差為3.4%～10.7%。該海洋膠體中含有16種氨基酸，總量為150.83μmol/L。肖禮娥［43］同樣利用OPA柱前衍生法測(cè)定醋粉中氨基酸的含量，結(jié)果表明各種氨基酸能達(dá)到基線分離。

2.3.2.2 異硫氰酸苯酯(PITC)法 異硫氰酸苯酯(PITC)和氨基酸的反應(yīng)產(chǎn)物苯基硫酸鹽-氨基酸具有穩(wěn)定性，且PITC與氨基酸和亞氨基酸均能反應(yīng)，衍生物穩(wěn)定性好。呂艷［44］采用異硫氰酸苯酯柱前衍生法分析多肽中18種氨基酸組成。檢測(cè)乳品中谷氨酰胺含量時(shí)，韓立強(qiáng)［45］通過(guò)谷氨酰胺與雙(1，1-三氟乙酸基)碘苯(BTI)反應(yīng)后酸水解，再用異硫氰酸苯酯衍生后，用HPLC檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此方法能夠?qū)θ槠分械腉ln進(jìn)行很好的定量。

2.3.3 熒光檢測(cè) 熒光檢測(cè)法，是通過(guò)使氨基酸與衍生試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，生成的氨基酸衍生物能夠用熒光分光光度計(jì)分析，從而得知被測(cè)氨基酸的含量。通常，衍生試劑包括鄰苯二甲醛(OPA)、丹酰氯(DANSYL-Cl)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)［46］。

2.3.3.1 鄰苯二甲醛(OPA)OPA衍生法可以快速與氨基酸反應(yīng)生成發(fā)熒光團(tuán)物質(zhì)，并在很短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)入靈敏度很高的熒光檢測(cè)器檢測(cè)。鄧櫻花［47］利用OPA衍生法檢測(cè)了七種神經(jīng)遞質(zhì)氨基酸，待測(cè)氨基酸與衍生劑反應(yīng)1min便可進(jìn)行分析檢測(cè)。桂莉［48］也采用 OPA法測(cè)定微透析液中天門(mén)冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、γ-氨基丁酸(GABA)的含量。結(jié)果興奮性Asp、Glu及抑制性Gly、GABA在18min內(nèi)完全分離，在0.625～5μmol/L濃度范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。

2.3.3.2 氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl) 在pH為7.7時(shí)反應(yīng)生成穩(wěn)定衍生物，一級(jí)、二級(jí)氨基酸全可檢測(cè)，熒光檢測(cè)靈敏度可達(dá)1×10-15mol水平。但是FMOC -Cl與His形成單、雙衍生物的比例不穩(wěn)定，影響定量;FMOC-Cl及其水解產(chǎn)物FMOC-OH有熒光干擾［41］。

3 結(jié)語(yǔ)

蛋白質(zhì)水解是制備氨基酸最簡(jiǎn)單最容易的方法，不同的水解方法對(duì)于氨基酸含量的獲得有不同的影響，酸水解和堿水解蛋白質(zhì)能夠快速獲得產(chǎn)物，但是對(duì)氨基酸的種類(lèi)和環(huán)境都有一定影響。酶水解蛋白質(zhì)具有安全、高效的優(yōu)點(diǎn)，但是其成本較高。

上述各種氨基酸的分析方法各具特點(diǎn)，采用何種方法，需根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件、分析速度、檢測(cè)靈敏度、干擾因素、樣品的種類(lèi)等各項(xiàng)指標(biāo)與實(shí)際要求做出選擇。

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Research of protein degradation and amino acid detection

SUN Qiu-jun，CHEN Xiao-ye，ZHU Jian-liang
(College of Life Science and Pharmacy，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China)

Methods of protein degradation were summaried，including acid hydrolysis，alkaline hydrolysis，enzymatic and ultrasound-assisted hydrolysis，and comparing the advantages and disadvantages of each method.Then methods of amino acid detection were summaried from the angle of detection，including chemical analysis， electrochemical analysis and spectrophotometry.

protein;degradation;amino acid;detection

TS201.2+4

A

1002-0306(2011)11-0525-04

2010-10-13

孫秋君(1985-)，女，碩士研究生，從事可再生能源利用的研究。