脊髓繼發(fā)性損傷大鼠動(dòng)物模型的制作

孫莉莉 周酈楠

急性脊髓損傷后開始時(shí)常為不完全性，最后結(jié)果常為兩種損害機(jī)制引起:原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷(SSCI)。繼發(fā)性脊髓損傷為傷后幾小時(shí)至幾天發(fā)生的一系列損傷激活的自身破壞過程，使最初病灶周圍原來完整的組織發(fā)生自身破壞性病變，周圍神經(jīng)功能損害逐漸發(fā)展。所產(chǎn)生的脊髓損害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了原發(fā)性損傷[1]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 雄性SPF大鼠60只，電子顯微鏡，化學(xué)試劑。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 本實(shí)驗(yàn)選用雄性健康SPF大鼠60只，體重260～300 g，正常對(duì)照組:20只。動(dòng)物模型組的組織化學(xué)染色:20只。動(dòng)物模型組的電子顯微鏡組:20只。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 繼發(fā)性脊髓損傷大鼠模型制備 1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉動(dòng)物(30 mg/kg)，俯臥位固定于立體定位儀上。以T10為中心暴露上下位錐板，咬除椎板，保持硬脊膜完整。在T10階段節(jié)段脊髓表面墊一曲度與脊髓表面一致的3 mm×8 mm塑料片，用30 g重物垂直壓迫T10節(jié)段脊髓10 min，逐層縫合肌肉皮膚。符合以下條件的大鼠歸入損傷組:壓迫時(shí)身體痙攣性顫動(dòng)、尾巴痙攣性擺動(dòng)、雙下肢及軀體回縮樣撲動(dòng);壓迫后硬脊膜內(nèi)充血或水腫，雙下肢呈遲緩性癱瘓，斜板實(shí)驗(yàn)測定最大角度＜30°。對(duì)照組大鼠只暴露脊髓。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物，4%多聚甲醛灌注固定，無菌條件下取損傷節(jié)段脊髓組織約1.0 cm，液氮保存或石蠟包埋。

1.3.2 組織染色標(biāo)本的取材 對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用1%戊巴比妥鈉(40 ml/kg)腹腔麻醉后開胸，經(jīng)左心室70滴/min滴入1%肝素鈉的生理鹽水500 ml，同時(shí)剪開右心耳。繼用0.1 m磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)配制的固定液(含4%多聚甲醛)灌流固定。取出實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脊髓組織，放入含4%多聚甲醛PBS的固定液中進(jìn)行后固定大約2 h，之后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的脊髓組織切成薄片移入含20%蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至組織薄片沉底，經(jīng)水包埋，恒冷箱連續(xù)橫切片，片厚20 μm。經(jīng)OCT包埋，恒冷箱連續(xù)切片，片厚16 μm，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 電子顯微鏡組織標(biāo)本的取材 在1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)腹腔麻醉下，用含1%肝素鈉生理鹽水200 ml快速?zèng)_洗后，用2%多聚甲醛及2.5%戊二醛的0.1 m磷酸緩沖液250 ml灌流固定，灌流后立即取腦，切取脊髓組織塊置于4℃，2.5%戊二醛中固定24 h，經(jīng)1%鋨酸固定1 h后，常規(guī)脫水，Epon812包埋，L.K.B超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，日立H-600透射電鏡觀察并拍片。

1.3.4 尼氏染色 冰凍切片吹干，經(jīng)PBS漂洗5 min 3次，將切片置入1%甲苯胺藍(lán)溶液中37℃孵育90 min，取出后用蒸餾水沖洗，PBS漂洗5 min 3次，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 尼氏染色結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠脊髓前角細(xì)胞的尼氏染色切片上，神經(jīng)元數(shù)量較多，排列緊密，形態(tài)完整，細(xì)胞漿有內(nèi)尼氏體。

動(dòng)物模型組大鼠脊髓，肉眼可見大鼠脊髓損傷局部組織充血。鏡下可見SCCI后3～6 h損傷局部神經(jīng)元核固縮，胞體縮小，胞質(zhì)深伊紅染色，成為紅色是神經(jīng)元。傷后1～3 d，軸突腫脹，出現(xiàn)空泡，白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)髓鞘散亂、崩解破裂。傷后3～7 d膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，可見衛(wèi)星現(xiàn)象及鬼影細(xì)胞。傷后14 d，損傷段脊髓變細(xì)部分灰質(zhì)崩解壞死，可見囊腔形成。正常神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，細(xì)胞豐滿，泡漿內(nèi)尼氏體豐富。

2.2 透射電鏡結(jié)果 動(dòng)物模型組大鼠脊髓前角神經(jīng)元細(xì)胞:核皺縮、核膜部分溶解、消失;線粒體腫脹、嵴紊亂甚至缺失;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、脫顆粒;高爾基體扁平囊腔擴(kuò)張;突觸數(shù)量減少、前后膜融合、突觸小泡不清或出現(xiàn)聚集。

根據(jù)尼氏染色及電鏡觀察說明繼發(fā)性脊髓損傷大鼠模型制備成功。

[1]Shoshani T，F(xiàn)aerman A，Mett I，et al.Identification of a novel hypoxia-inducible factor 1-responsive gene，RTP801，involved in apoptosis．Mol Cell Biol，2005，22(7):2283-2293．