冰凍切片免疫熒光細(xì)胞技術(shù)的改良

鄭燕璇 王曉鴻 孟曉軍

冰凍切片免疫熒光細(xì)胞技術(shù)的改良

鄭燕璇 王曉鴻 孟曉軍

由于免疫熒光細(xì)胞化學(xué)的特異性、快速性和在細(xì)胞水平定位的敏感性與準(zhǔn)確性，已在病理學(xué)診斷方面得到廣泛應(yīng)用。本文就我科多年的熒光技術(shù)實(shí)際操作中的經(jīng)驗(yàn)體會(huì)做個(gè)介紹。

冰凍切片;免疫熒光細(xì)胞化學(xué);免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)［1］是現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中廣泛應(yīng)用的技術(shù)之一，由于其特異性、快速性及準(zhǔn)確性，在病理學(xué)診斷方面已得到廣泛應(yīng)用，其中以直接法更為簡(jiǎn)便、快速?，F(xiàn)就我們科多年來(lái)在腎穿、皮膚組織免疫熒光操作中的體會(huì)做個(gè)總結(jié)。

1 資料與方法

1.1 材料 腎穿、皮膚組織冰凍切片數(shù)張熒光抗體

1.2 方法［2］①將腎穿、皮膚標(biāo)本置于恒溫冷凍機(jī)的冷凍頭上，加少許OCT包埋劑，于冷室內(nèi)－25℃冷凍切片，厚度要求3～4 um，根據(jù)所備抗體切出相應(yīng)數(shù)量的片子［3］;②用冷風(fēng)機(jī)將切片吹干;③將pH7.4的PBS液平鋪于切片上，浸泡2 min;④將稀釋好的熒光抗體滴于切片上，在37℃溫箱內(nèi)孵育8～10 min;⑤甩去切片上的熒光抗體，用pH7.4的PBS液平鋪浸泡切片2 min;⑥用紙巾擦去組織周邊的液體，滴加緩沖甘油封片。

2 結(jié)果

根據(jù)顯現(xiàn)的熒光強(qiáng)度來(lái)判斷免疫復(fù)合物的多少，其觀察結(jié)果［4］分為6級(jí):鏡下未見(jiàn)免疫復(fù)合物熒光:-;高倍下隱約可見(jiàn):±;低倍鏡下隱約可見(jiàn)、高倍鏡下可見(jiàn):+;低倍鏡下可見(jiàn)、高倍鏡清晰可見(jiàn):++;低倍鏡下清晰可見(jiàn)，高倍鏡下耀眼:+++;低倍鏡下耀眼，高倍鏡下刺眼:++++。

3 討論

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)［5］是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱(chēng)為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù)。

免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、間接法和補(bǔ)體法，其中直接法是最簡(jiǎn)便、快速的方法。用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異性熒光抗體，直接用于細(xì)胞或組織抗原的檢查，此法特異性高，在病理學(xué)診斷方面得到廣泛應(yīng)用。

傳統(tǒng)的免疫熒光操作步驟［6］是:①冰凍切片在室溫下電風(fēng)扇吹干;②pH7.4的PBS液中洗片數(shù)次;③熒光素標(biāo)記的特異性抗體以pH7.4 0.01 mol/L的PBS液稀釋20倍，滴于切片上，在37℃溫箱內(nèi)孵育15～30 min;④PBS液中洗切片5 min×2次，洗去未與組織結(jié)合的抗體;⑤室溫下輕度風(fēng)干切片;⑥滴加緩沖甘油封片。

我們科在多年實(shí)際操作中，對(duì)免疫熒光傳統(tǒng)操作方法進(jìn)行了改良，現(xiàn)介紹如下:①在制備冰凍切片上，皮膚組織與腎穿組織有所不同，因其結(jié)構(gòu)特殊性使得皮膚組織在熒光操作中易掉片，因此在做皮膚熒光時(shí)，我們選用了防脫載玻片;②將冰凍切片用PBS液平鋪，浸泡2 min。在以往操作中，我們用PBS液沖洗切片數(shù)次(清除組織周邊的包埋劑及未與組織結(jié)合的特異性熒光抗體)，不管操作過(guò)程如何小心，在觀看熒光時(shí)總能見(jiàn)到組織或部分脫落、或部分重疊，影響熒光結(jié)果的判斷。在改用PBS液平鋪浸泡切片后，不僅能避免組織脫落、重疊，而且切片經(jīng)浸泡后，組織周邊的包埋劑清洗干凈，免疫熒光背景清晰;③特異性熒光抗體用pH7.4 0.01 mol/L的PBS液稀釋30倍，尤其在皮膚熒光時(shí)，其特異性抗體IgG我們甚至稀釋到120倍，避免抗體濃度過(guò)高造成的假?gòu)?qiáng)陽(yáng)性;④熒光抗體與組織孵育時(shí)間改為8～10 min，此時(shí)觀察熒光效果較好。孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，熒光已開(kāi)始衰退，影響診斷。經(jīng)過(guò)對(duì)免疫熒光傳統(tǒng)操作方法的改良，我們不僅節(jié)省了抗體，縮短了操作時(shí)間，而且避免了組織脫片及背景著色，提高了染片效果。

［1］ 王伯沄，李玉松.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù).病理學(xué)技術(shù)，2000，381.

［2］ 鄭燕璇，王曉鴻.腎活檢標(biāo)本的檢查方法及意義.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2010，102.

［3］ 王伯沄，李玉松.組織切片技術(shù).病理學(xué)技術(shù)，2000，88.

［4］ 鄒萬(wàn)忠，王海燕.腎活檢標(biāo)本的處理和病理檢查方法.腎活檢病理學(xué)，2006，24.

［5］ 王伯沄，李玉松.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù).病理學(xué)技術(shù)，2000，380.

［6］ 王伯沄，李玉松.腎活檢標(biāo)本的制作技術(shù).病理學(xué)技術(shù)，2000，949.

519000 中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院病理科

通迅作者:王曉鴻 E-mail:david_20070424@126.com