多酚氧化酶酶學(xué)特性研究及其應(yīng)用進(jìn)展

孔俊豪，孫慶磊，涂云飛，陳小強(qiáng)，高玉萍，楊秀芳

(中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016)

多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，以下簡述為PPO)是核基因編碼的銅金屬酶，廣泛存在于植物體的各類器官或組織中，如花器官、分生組織、葉片、塊莖、根中，在傘菌目子實(shí)體內(nèi)含量也較豐富。在正常狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)多酚氧化酶與細(xì)胞器內(nèi)膜結(jié)合，活性很低，但遭遇外界逆境時(shí)，PPO可以增加植物體對(duì)病原體的抗性［1］。然而當(dāng)組織完整性破壞或膜受到傷害后，潛在的PPO大量被激活，質(zhì)體內(nèi)的多酚類物質(zhì)在PPO作用下氧化成醌，植物組織的褐變隨之發(fā)生。此外，在茶葉加工中，可依據(jù)不同的加工工序來協(xié)同調(diào)控PPO活性從而制成品質(zhì)與滋味迥異的不同茶類［2］。

1 影響酶活的主導(dǎo)因素

1.1 來源

不同來源的PPO對(duì)于專一性底物的親和力存在很大差別，部分原因在于同空間因子相關(guān)的酶蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異。吳進(jìn)菊等［3］對(duì)多種植物和真菌中PPO的催化活性進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，茄子＞雙孢蘑菇＞蘋果＞梨＞山藥＞馬鈴薯＞芋艿＞香蕉＞萵苣(比酶活)。同一植株內(nèi)，不同成熟度、不同部位的PPO酶活性也有差異，一般在幼嫩部分酶活總量高于成熟部分。周春梅等的研究表明，白玉菇下柄的PPO酶活性最高，菌柄的PPO酶活性高于菌蓋的PPO酶活性。姜紅波等［4］對(duì)茶樹菇不同部位的粗酶液活性測(cè)定表明，菌柄下酶活性最小;菌蓋與菌褶處酶活性較大。與同類研究［5］得出的結(jié)論相似。

1.2 底物

PPO在不同的底物體系(一元酚和鄰二酚)中，可以催化完全不同的氧化反應(yīng)。底物不僅取決于植物組織、真菌子實(shí)體的種類，而且從同一種果蔬的不同品種分離得到的PPO也具有底物特異性。劉雅嘉等［6］研究了香菇PPO基于不同底物的Km值，其與三種底物間的親和力強(qiáng)弱依次為L－多巴＞一水沒食子酸＞鄰苯二酚。

王麗霞等［7］以福云六號(hào)茶鮮葉為原料，以鄰苯二酚為反應(yīng)的底物，探討了其中多酚氧化酶的特性，結(jié)果表明，在供試反應(yīng)體系中，酶活性隨底物量逐漸增長，但底物含量過高也會(huì)產(chǎn)生抑制作用。

1.3 作用溫度

溫度對(duì)于酶的催化活力具有重要的影響。PPO溫敏性較強(qiáng)，多數(shù)情況下，在70～90℃下短時(shí)熱處理已足以使它部分或全部地不可逆失活。

而PPO酶的熱穩(wěn)定性在一定程度上亦決定于其來源，存在于不同的質(zhì)體、組織或同一的質(zhì)體不同部位的PPO，其對(duì)熱處理的耐受度有差異，宋金隆等［8］比較了茶樹鮮葉、馬鈴薯、蘋果中的PPO酶活性，表明不同來源，最適催化溫度的不同，但溫度變化對(duì)酶活力的影響趨勢(shì)大體一致。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，茶葉PPO活性隨著溫度的變化呈現(xiàn)出先強(qiáng)后弱的趨勢(shì)，高溫對(duì)酶活的抑制作用更為明顯［9］。低溫效應(yīng)度對(duì)酶活力的影響主要是降低PPO催化活力或使之處于可逆失活狀態(tài)。夏濤等［10］研究了冷凍萎凋?qū)Σ枞~PPO的影響，低溫凍結(jié)狀態(tài)下酶活變化不顯著，但復(fù)溫萎凋后活性下降達(dá)一半以上，溫差造成細(xì)胞破裂致酶活損失。因此調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度可以有效調(diào)控、提高PPO的催化活性。

1.4 pH 值

PPO作用的最適pH隨酶的來源和選用的底物而變。多數(shù)情況下，果蔬中的 PPO最適 pH在4.2～7.0之間，不同的作用底物、提取緩沖液、分離方法對(duì)酶的最適pH也有影響，因此PPO的最適pH只在一定條件下才有意義［11］。在一些情況下，PPO具有兩個(gè)最適pH，同工酶或多種分子形式是其可能原因之一。

李敏等［12］發(fā)現(xiàn)馬鈴薯PPO粗酶液活性隨體系pH增加而增強(qiáng)，最適pH約在5.5處，同類研究［13］證實(shí)，楊梅果實(shí)中PPO活性隨pH變化趨勢(shì)與上述一致，受試范圍體系pH接近中性時(shí)，PPO催化活性最強(qiáng)。不同真菌果實(shí)中PPO的活性變化均與pH之間存在一定相關(guān)性［14］。

1.5 儲(chǔ)放條件

果蔬采后其PPO在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)仍處于生理活性狀態(tài)，對(duì)于植物質(zhì)體的調(diào)節(jié)水平隨儲(chǔ)藏條件而變。朱鳳妹等［15］研究發(fā)現(xiàn)，與新采馬鈴薯相比，貯藏一定時(shí)間后的馬鈴薯中總體PPO活性趨于下降。程建軍等［16］對(duì)蘋果梨中PPO活性在室溫儲(chǔ)藏過程中變化規(guī)律，蘋果梨PPO活性先呈降低趨勢(shì)，而后緩慢恢復(fù)，但活性變動(dòng)幅度無統(tǒng)計(jì)顯著性，室溫保藏期間PPO活性高于低溫保藏，呼吸強(qiáng)度大，刺激多酚類物質(zhì)氧化聚合，破壞了PPO－多酚類物質(zhì)之間的動(dòng)態(tài)平衡，加速了果肉褐變。

2 酶活的輔調(diào)因素

2.1 激活劑和抑制劑

為防止酶促褐變，食品界在PPO的抑制劑方面開展了很多研究工作，而對(duì)于其激活劑相對(duì)了解較少。

陰離子洗滌劑如SDS(十二烷基硫酸銨)能激活PPO。SDS不僅可激活經(jīng)PVP處理而失活的酶，而且也能夠激活以潛在形式存在于粗提液中的PPO。適宜的添加濃度范圍內(nèi)，SDS對(duì)煙草PPO及嫩刺芽PPO均有一定的激活作用［17－18］。PPO的活性形式是含銅的酶單體的寡聚體，因此含Cu2+的化合物對(duì)源于小麥等的PPO也有激活效應(yīng)［19］。

此外，金屬離子能以不同的方式與底物、酶的活性產(chǎn)物和酶本身產(chǎn)生極強(qiáng)的親和力，從而導(dǎo)致酶活性的改變。Ca2+和Na+能對(duì)酶活性產(chǎn)生抑制作用，Al3+、Fe3+、Cd2+、Co2+、Mn2+和 Zn2+則激發(fā)酶的催化功能［20］。

PPO的抑制劑依據(jù)其作用機(jī)制不同可分為酶基抑制劑和產(chǎn)物(或底物)抑制劑兩類，第一類中具有產(chǎn)業(yè)應(yīng)用價(jià)值的是抗壞血酸和檸檬酸，第二類中較有代表性的有二氧化硫、半胱氨酸、亞硫酸鹽等。就茶葉PPO而言，NaHSO3對(duì)其抑制作用最顯著，其次為L－半胱氨酸、抗壞血酸和EDTA，效果最差的為NaCl［7］，半胱氨酸對(duì)多種植物，如蘋果、馬鈴薯、香蕉等體內(nèi)的PPO都有抑制作用［21－23］。也有學(xué)者通過抑制劑復(fù)合協(xié)同進(jìn)行抑褐保鮮，篩選得到了山藥最佳感官風(fēng)味的PPO抑制劑配方:0.05%檸檬酸+0.4%抗壞血酸 +0.02%EDTA［24］。

2.2超高壓

超高壓，又稱液態(tài)高靜壓，以水和礦物油作為傳遞壓力的介質(zhì)，施加高靜壓(100～1 000 MPa)，并維持一定時(shí)間后可以改變食品的物化特性和化學(xué)反應(yīng)速度，達(dá)到殺菌和改變酶活性的一種加工方法。和熱協(xié)同處理可以減少果蔬中熱敏物質(zhì)的流失，低溫?zé)崽幚砑纯蛇_(dá)到顯著性鈍化PPO的效果，但不同的壓力可對(duì)PPO的活性產(chǎn)生抑制或激活作用［25－26］。

2.3 微波輻照

微波滅酶處理具有熱特性和非熱特性。輻照對(duì)茶葉中PPO活性的抑制程度受劑量影響，低于或高于最佳劑量均不能達(dá)到理想的效果［27］，輻照處理協(xié)同理化因子調(diào)控可提高對(duì)酶活力的抑制程度，研究表明3kGy輻照劑量與適宜pH復(fù)合處理能夠抑制梨汁中92%的PPO活性［28］。微波作用改變酶液中的鍵合作用，從而改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象［29］，體系在生物效應(yīng)和熱效應(yīng)的雙重作用下，PPO活性被迅速鈍化。

2.4 脈沖電場(chǎng)

脈沖場(chǎng)通過電場(chǎng)強(qiáng)度的變化改變PPO的二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響其構(gòu)象從而使酶滅活［30］，而且酶的殘余活性隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度和脈沖數(shù)的增加而逐漸降低，最高滅活率可達(dá)90%以上［31］。

2.5 振動(dòng)

振動(dòng)脅迫在一定程度上也對(duì)PPO有抑制作用。肖麗娟等［32］研究發(fā)現(xiàn)水蜜桃果實(shí)在貯藏過程中，振動(dòng)處理組PPO活性始終高于對(duì)照組，并且振動(dòng)時(shí)間越長PPO活性越高。茶葉初制加工過程中，經(jīng)振動(dòng)處理的茶鮮葉PPO活性會(huì)迅速降低，振動(dòng)強(qiáng)度越大，下降越快［33］。

3 應(yīng)用研究進(jìn)展

PPO對(duì)于果蔬保鮮和采后加工具有重要意義，為避免褐變?cè)斐傻氖称菲焚|(zhì)下降，加工過程中PPO酶的鈍化處理一直是研究的熱點(diǎn)，而在不同茶類加工過程中合理調(diào)控茶葉PPO活性對(duì)于茶葉品質(zhì)的提升。

3.1 果蔬保鮮褐變控制中的應(yīng)用

PPO抑制在防止水果和蔬菜褐變方面起著重要的作用。抑制PPO活性或消除酶促反應(yīng)的發(fā)生條件能較好地保持鮮果的色澤、風(fēng)味及營養(yǎng)。酶促褐變的發(fā)生需要三個(gè)條件:底物(多酚類物質(zhì))、氧介質(zhì)、PPO［34］。實(shí)際操作中從食品中除去PPO的底物(多酚類物質(zhì))不僅困難，而且不現(xiàn)實(shí)。因此比較有效的是抑制PPO活性，其次是防止與氧接觸。

3.1.1 溫度調(diào)控

冰溫保藏，是將食品貯藏在0℃以下至各自的凍結(jié)點(diǎn)的范圍內(nèi)的保鮮方式，繼冷藏和氣調(diào)之后，成為第三代保鮮技術(shù)。冰溫可以抑制PPO酶活，減少總酚含量的下降趨勢(shì)，對(duì)果蔬的保鮮有著明顯的作用。冰溫貯藏作為一種新型的物理保鮮方法，研究表明［35］其對(duì)蓮藕保質(zhì)期比冷藏要長，并且冰溫貯藏后的果實(shí)以低溫冷鏈方式出庫后其PPO在貨架期內(nèi)始終處于較低水平［36］，對(duì)于延長鮮食果蔬的貨架壽命收效顯著。

瞬時(shí)高溫可使包括PPO在內(nèi)的酶鈍化，熱處理是生產(chǎn)中常用鈍酶方法之一，通常以PPO作為熱燙指示劑，常以蒸汽或熱水為濕媒介，通過熱燙或漂燙工藝用于壓榨果汁的預(yù)處理［37］，提高產(chǎn)品中功能成分含量，改善速凍食品的感官品質(zhì)和風(fēng)味，不過在工業(yè)中漂燙的最佳終點(diǎn)判斷至關(guān)重要。不同的果蔬品種，具體處理參數(shù)不同，適度的處理時(shí)間內(nèi)亦可提高出汁率，時(shí)間過長則會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)成分流失［38］。

3.1.2 酸度調(diào)控

大多PPO最適pH值在6.0～7.4范圍，在pH值降至4.0以下，PPO幾乎完全失去活性。因此利用調(diào)酸降低pH值的方法抑制果蔬褐變，是果蔬加工中常用的方法?？刹捎眉尤脒m量的pH調(diào)節(jié)劑如檸檬酸、蘋果酸、醋酸等降低pH值，抑制褐變發(fā)生率，多為兩種或兩種以上復(fù)合使用，且符合食用級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。喬勇進(jìn)等［39］研究表明pH對(duì)貯藏梨汁褐變影響較大，隨著pH降低，梨汁褐變度越大。

3.1.3 抑制劑調(diào)控

Vc、NaHSO3、L－Cys、EDTA 對(duì)各種來源的 PPO的活性都有抑制作用。Vc不僅可降低環(huán)境pH值，它與異Vc鈉既能抑制PPO本身的催化作用，同時(shí)又能還PPO形成的產(chǎn)物醌為酚，并且還能消耗反應(yīng)體系中的氧而L－Cys既能與醌形成無色的聚合物，又是醌的還原劑，還原醌為酚［40］。另外EDTA可與酶分子中Cu2+絡(luò)合抑制酶活性，甚至飽和NaCl也能顯著抑制酶活性［1，7］。因此適量加入這些抑制劑來抑制PPO活性是控制酶促褐變的有效途徑之一。在實(shí)際生產(chǎn)中較為理想的抑制劑是Vc，這是由于Vc是水果中的成分，安全性高，因此在工業(yè)生產(chǎn)中可以廣泛地應(yīng)用。

3.2 茶葉加工中的應(yīng)用

3.2.1 綠茶殺青

綠茶加工過程中，關(guān)鍵工序是殺青，通過高溫(100～300℃)使鮮葉中的酶迅速變性失活，及時(shí)終止鮮葉中包括PPO在內(nèi)的各類酶促反應(yīng)，使成品茶保留較多的葉綠素、多酚類、維生素C等熱敏性品質(zhì)成分，從而形成綠茶“清湯綠葉”的品質(zhì)。傳統(tǒng)的殺青方法包括蒸氣殺青、鍋炒殺青，近年來有微波殺青、遠(yuǎn)紅外輔助殺青、超高壓等新技術(shù)用于綠茶殺青處理過程［41－43］，對(duì)于酶質(zhì)的活性進(jìn)行柔性鈍化，更有利于茶葉理化成分的保留和優(yōu)良品質(zhì)的形成。

3.2.2 紅茶發(fā)酵

紅茶屬酶性氧化茶類，須滿足多酚類酶性氧化聚合反應(yīng)所需要的最適溫度、濕度和氧氣條件。經(jīng)萎凋、揉切后，茶葉中PPO酶類活性得到激活，PPO與多酚類及空氣充分接觸，使多酚類中的沒食子兒茶素及其沒食子酸酯先行氧化為鄰醌，再逐步氧化縮合，成為茶黃素和茶紅素，使紅茶具有湯色葉底紅亮、香味濃郁等獨(dú)特品質(zhì)。

日本靜岡茶試站早在20世紀(jì)90年代即通過在紅茶發(fā)酵過程中添加外源微生物PPO以提高茶黃素的合成量，以此改善紅茶品質(zhì)［44］。近年來國內(nèi)也有將外源引入液態(tài)發(fā)酵協(xié)同茶葉自源PPO進(jìn)行茶制品生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)過程的動(dòng)態(tài)調(diào)控，以提高產(chǎn)品品質(zhì)和制率［45］。

此外半發(fā)酵茶如烏龍茶的萎凋、搖青工序及白茶的萎凋等均屬利用茶青中PPO酶的活性進(jìn)行初制加工形成特征各異的茶類成品。采用差異化工藝條件的控制，利用或抑制茶葉PPO的活性從而借助不同的氧化伴生反應(yīng)形成品質(zhì)獨(dú)特的茶類產(chǎn)品開發(fā)已成為當(dāng)前茶葉加工的一大研究熱點(diǎn)。

4 應(yīng)用研究展望

多酚氧化酶是生物質(zhì)體的自源代謝酶類，不僅在生物體的生長期維持自體次生代謝的平衡，也與果蔬采后生理和再加工產(chǎn)品品質(zhì)有著緊密的聯(lián)系?？刂乒咧诩庸?、儲(chǔ)藏過程中的酶促褐變，保留、改善農(nóng)副產(chǎn)品的營養(yǎng)成分和感官品質(zhì)符合消費(fèi)者對(duì)健康產(chǎn)品的食用價(jià)值需求。

當(dāng)前，人們已經(jīng)從物料自身酶的活性和酶促反應(yīng)的輔助因子、外界環(huán)境等的控制等多方面入手，找到了多種控制果蔬汁中酶促褐變的有效方法。但是因?yàn)椴煌呶锪现械腜PO具有特異性，根據(jù)果蔬品種的不同，單一的方法存在一定的局限性。隨著非熱加工技術(shù)的發(fā)展，超高壓、輻照、脈沖場(chǎng)、冰溫貯藏等在酶作用機(jī)制方面的廣泛研究和協(xié)同化應(yīng)用，為果蔬加工過程控制褐變提供了相對(duì)廣闊的工業(yè)化技術(shù)和理想方法。

同樣，PPO作為茶葉產(chǎn)品加工過程中的重要品質(zhì)決定因素，隨著市場(chǎng)差異化產(chǎn)品的需求，應(yīng)用新型加工技術(shù)及酶工程技術(shù)，針對(duì)性地創(chuàng)設(shè)PPO活性調(diào)控的理化條件，充分發(fā)揮PPO的生理催化優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)而專一性改善茶葉產(chǎn)品中某一類成分的含量，提高茶制品的風(fēng)味和質(zhì)量，將會(huì)是未來新型茶制品開發(fā)的一大研究亮點(diǎn)，有著廣闊的應(yīng)用前景。

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