植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對(duì)過敏原原肌球蛋白免疫活性的消減作用

肖 葉，葉精勤，李曉晨，李曉暉，施文正，盧 瑛,*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；2.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，上海 201306）

蝦和龍蝦等甲殼類水產(chǎn)品因富含優(yōu)質(zhì)蛋白、必需氨基酸和微量元素而廣受消費(fèi)者青睞。近年來，甲殼類水產(chǎn)品的養(yǎng)殖量和人均消費(fèi)量不斷增長(zhǎng)，從水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)擴(kuò)張之初的1990年到2017年，甲殼類水產(chǎn)品的人均消費(fèi)量年增長(zhǎng)率達(dá)到2.9%[1]。因此由甲殼類水產(chǎn)品引發(fā)的過敏問題也一直受到社會(huì)各界的廣泛關(guān)注，它不僅影響了己知過敏人群對(duì)甲殼類水產(chǎn)品的攝取，而且對(duì)潛在過敏人群存在嚴(yán)重的安全隱患，甚至危及生命。原肌球蛋白（tropomyosin，TM）是甲殼類和貝類的主要過敏原，它是一種酸性糖蛋白，分子質(zhì)量約為35～38 kDa，由2 個(gè)相同的α-螺旋結(jié)構(gòu)的亞基相互纏繞構(gòu)成超螺旋結(jié)構(gòu)，包含7 個(gè)交互的肌動(dòng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且耐高溫[2]。

乳酸菌是人體腸道中必不可少的一種有益于身體健康的細(xì)菌，且大量存在于人體內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可以解離食物中的蛋白質(zhì)、糖分以及合成維生素等，從而達(dá)到提高食物消化率和生物價(jià)，促進(jìn)人體對(duì)食物消化吸收的目的[3]。Frias等[4]利用瑞士乳桿菌、枯草芽孢桿菌、米根霉和釀酒酵母混合菌種發(fā)酵大豆蛋白，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的大豆過敏原的致敏性顯著降低。高卿等[5]選用木糖葡萄球菌發(fā)酵海鱸魚，結(jié)果顯示發(fā)酵60 h后小清蛋白的IgG結(jié)合能力下降26.9%，IgE結(jié)合能力下降22.3%。Bu Guanhao等[6]在牛乳中分別接入L.helveticus和S.thermophilus2 種乳酸菌，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明α-乳白蛋白的致敏性在發(fā)酵后分別降低了71%和49%，當(dāng)2 種菌混合發(fā)酵牛乳時(shí)，α-乳白蛋白的致敏性降低了87%。Jedrychowski等[7]得到了一致的結(jié)論。

目前，國(guó)內(nèi)外利用加熱[8]、輻照[9]、美拉德反應(yīng)[10]、酶解[11]等方法消減原肌球蛋白的免疫活性和致敏性的研究較多，然而利用乳酸菌消減過敏原原肌球蛋白的免疫活性和致敏性的報(bào)道很少。為探究植物乳桿菌L.plantarum對(duì)原肌球蛋白免疫活性的影響，解析植物乳桿菌消減TM免疫活性的作用位點(diǎn)，本研究利用植物乳桿菌的完整菌體、破碎菌體（破碎內(nèi)容物、菌體碎片、胞內(nèi)酶提取液）以及化學(xué)修飾菌體提取物（去除蛋白、去除脂肪、去脂磷壁酸、羧基酯化、氨基甲基化）分別水解TM，分析比較植物乳桿菌不同成分提取物對(duì)TM免疫活性的影響差異，然后利用表位多克隆抗體及紅外光譜技術(shù)研究不同成分提取物對(duì)TM二級(jí)結(jié)構(gòu)及其致敏表位的影響，探究TM免疫活性變化與結(jié)構(gòu)及致敏表位變化的構(gòu)效關(guān)系，為食物過敏原的活性控制及低致敏性水產(chǎn)加工制品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南美白對(duì)蝦（Penaeus vannamei） 市購。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）由上海海洋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；MRS培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；預(yù)染色和未染色的蛋白質(zhì)標(biāo)記物 立陶宛Fermentas公司；96 孔板 美國(guó)Corning公司；山羊抗小鼠IgG-HRP抗體 美國(guó)Invitrogen公司；N,N,N’,N’-四甲基二乙胺、DAB顯色試劑盒 美國(guó)Sigma公司；0.22 μm PVDF膜 美國(guó)Millipore公司。

針對(duì)甲殼類主要過敏原TM具有特異性反應(yīng)的單克隆抗體5G5E及針對(duì)致敏表位Epitope l（TKLAEASQAADESER）、Epitope 2（DEERM）、Epitope 3（FLAEEADRK）的多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Mini protean 4蛋白質(zhì)電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司；AE-8135半干式轉(zhuǎn)膜儀 日本ATTO公司；powerlook 2100XL-MSB凝膠掃描儀 美國(guó)MMAX公司；Synergy2多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；Z36HK高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Hermle公司；TS-8脫色搖床 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋國(guó)華電器有限公司；Spotlight 400傅里葉變換紅外光譜儀英國(guó)PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 TM的提取和富集

參照孫佳益[12]的方法，蝦去頭去殼去尾去蝦線后，絞肉機(jī)攪碎并加入冷丙酮抽提至丙酮溶液為無色，將沉淀物風(fēng)干并向其中加入含0.5 mmol/L DTT的磷酸鹽-吐溫緩沖液（phosphate buffered saline-tween，PBST），勻漿煮沸并離心35 min后向上清液中加入45%硫酸銨溶液，待硫酸銨全部溶解后離心35 min收集沉淀。將沉淀用PBS溶解并透析48 h，即得到富集純化的TM。

1.3.2 TM純度驗(yàn)證

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）根據(jù)Laemmli[13]的方法進(jìn)行。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。將不同樣品分別與2×上樣緩沖液混合并煮沸后加8 μL到樣品孔中，設(shè)置電源電壓進(jìn)行跑膠，電泳結(jié)束用考馬斯亮藍(lán)染色液染色，然后脫色至蛋白條帶清晰。

1.3.3 植物乳桿菌不同成分提取物樣品的制備

1.3.3.1 活菌體制備

將活化3 代后的植物乳桿菌液體培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期末穩(wěn)定期初，調(diào)整菌濃度使其含菌量在1×108CFU/mL以上，取1 mL菌液，離心（12 000 r/min，4 ℃，15 min）收集沉淀，無菌PBS清洗3 次后保存于4 ℃待用。

1.3.3.2 破碎內(nèi)容物、菌體碎片和胞內(nèi)酶提取液制備

破碎內(nèi)容物制備：根據(jù)李秀明等[14]的方法略有改動(dòng)，向菌體中添加終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶菌酶并在30 ℃作用2 h，再用超聲波細(xì)胞破碎儀以功率200 W，超聲2 s、停2 s，超聲5 min后即得到菌體的破碎內(nèi)容物，4 ℃保存待用。

菌體碎片和胞內(nèi)酶提取液制備：將菌體的破碎內(nèi)容物離心（12 000 r/min，4 ℃，15 min），收集的沉淀為菌體碎片，收集的上清液為胞內(nèi)酶提取液，4 ℃保存待用。

1.3.3.3 去除蛋白、脂肪、脂磷壁酸樣品制備

去除蛋白樣品制備：根據(jù)Elnezami等[15]的方法略有改動(dòng)，將12 mg真空冷凍干燥的菌體溶解于1.2 mL 10 mmol/L的磷酸鈉緩沖溶液中（pH 7.6，含0.5 mg/mL蛋白酶），37 ℃搖床中反應(yīng)2 h，離心收集沉淀（12 000 r/min，4 ℃，15 min），無菌PBS清洗3 次后得到去除蛋白的菌體，4 ℃保存待用。

去除脂肪樣品制備：參考去除蛋白樣品的制備方法，將含有蛋白酶的緩沖溶液替換為1.2 mL 10 mmol/L的磷酸鈉緩沖溶液（pH 7.6，含0.5 mg/mL脂肪酶）[15]，其余操作不變，制得去除脂肪的菌體，4 ℃保存待用。

去脂磷壁酸樣品制備：參考郭春鋒[16]的方法略有改動(dòng)，將12 mg真空冷凍干燥的菌體溶解于1.2 mL正丁醇溶液，37 ℃搖床中反應(yīng)2 h，離心（12 000 r/min，4 ℃，15 min）收集沉淀，無菌PBS清洗3 次后得到去除脂磷壁酸的菌體，4 ℃保存待用。

1.3.3.4 羧基酯化和氨基甲基化樣品制備

羧基酯化樣品制備：參考Ramrakhiani等[17]的方法略有改動(dòng)，向真空冷凍干燥的菌體中加入1.2 mL甲醇-濃鹽酸（108∶1，V/V）混合溶液，125 r/min室溫反應(yīng)6 h后，離心（12 000 r/min，4 ℃，15 min）收集沉淀，無菌PBS清洗3 次后得到羧基酯化的菌體，4 ℃保存待用。

氨基甲基化樣品制備：參考Chen Huimei等[18]的方法略有改動(dòng)，向真空冷凍干燥的菌體中加入1.2 mL甲醛-甲酸（1∶2，V/V）混合溶液，之后參照羧基酯化樣品的制備方法制備得到氨基甲基化的菌體，4 ℃保存待用。

1.3.4 植物乳桿菌不同成分提取物對(duì)TM免疫活性影響作用評(píng)價(jià)

1.3.4.1 植物乳桿菌不同成分提取物水解TM

將植物乳桿菌不同成分提取物分別接入質(zhì)量濃度為2 mg/mL的TM溶液中，置于37 ℃搖床中（200 r/min）水解48 h，每隔12 h取一次樣，以未加乳酸菌，但在同等條件下（37 ℃、200 r/min）放置48 h的TM溶液作為對(duì)照。離心（12 000 r/min，4 ℃，10 min）收集上清液進(jìn)行免疫活性測(cè)定。

1.3.4.2 SDS-PAGE

參照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行。

1.3.4.3 蛋白免疫印跡

根據(jù)Song Yongna等[19]的方法進(jìn)行。根據(jù)SDS-PAGE法制得轉(zhuǎn)移膠，180 mA、20 min條件下將膠上條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后PBST洗膜3 次，每次5 min，然后用TM的特異性單抗5G5E（1 μg/mL）孵育1 h，洗滌后用HRP-羊抗小鼠IgG（1∶2 500）溶液孵育1 h，洗液洗滌，加入DAB工作液顯色5 min后用去離子水洗去殘留顯色液并風(fēng)干拍照。

1.3.4.4 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA

根據(jù)Kamath等[20]的方法進(jìn)行。將純化TM用50 mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋至4 μg/mL，每孔100 μL，4 ℃過夜包被，PBST溶液洗板3 次后加入200 μL 5%脫脂奶粉，37 ℃孵育2 h，洗滌。每孔加入100 μL不同產(chǎn)物和5G5E的混合液（混合液37 ℃提前孵育1 h），37 ℃孵育1 h，洗滌后加入100 μL HRP-羊抗小鼠IgG（1∶2 500），37 ℃孵育1 h，洗滌后加100 μL鄰苯二胺底物顯色液室溫避光反應(yīng)10 min，最后加2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，并立即測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的OD值。以50 mmol/L包被液為陰性對(duì)照，以抗體稀釋液稀釋的5G5E作為陽性對(duì)照，每個(gè)樣品做4 個(gè)平行。樣品中TM的抑制率和消減率按式（1）、（2）計(jì)算：

式中：OD陽性為陽性孔的OD值；OD樣品為樣品孔的OD值；OD陰性為陰性孔的OD值。

1.3.5 植物乳桿菌的不同成分提取物與TM致敏表位多抗間的結(jié)合反應(yīng)

1.3.5.1 表位多克隆抗體效價(jià)分析

參照1.3.4.4節(jié)方法，各表位用50 mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋至4 μg/mL作為包被抗原，不同稀釋倍數(shù)的表位多克隆抗體溶液分別作為一抗，采用ELISA測(cè)定表位多克隆抗體的效價(jià)。

1.3.5.2 植物乳桿菌的不同成分提取物與TM致敏表位多抗間的結(jié)合情況

參照1.3.4.4節(jié)方法，將TM的致敏表位Epitope l（TKLAEASQAADESER）、Epitope 2（DEERM）、Epitope 3（FLAEEADRK）的多克隆抗體分別作為一抗，采用ELISA檢測(cè)不同成分提取物水解前后TM蛋白質(zhì)與3 個(gè)致敏表位多克隆抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)，以TM蛋白質(zhì)為對(duì)照，表位多抗與水解樣品間的結(jié)合反應(yīng)變化率按式（3）計(jì)算：

式中：OD對(duì)照為TM對(duì)照樣品的ELISA檢測(cè)OD值；OD樣品為不同成分提取物的TM水解產(chǎn)物的ELISA檢測(cè)OD值。

1.3.6 紅外圖譜的采集與分析

將水解前后的TM樣品及植物乳桿菌樣品進(jìn)行真空冷凍干燥，直至樣品不含水分，取干燥樣品與KBr晶體按照1∶100的比例混合，壓片機(jī)壓成薄片，以空氣為背景，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)采集光譜，分辨率為±4 cm-1，信號(hào)累加32 次，每個(gè)樣品重復(fù)掃描3 次。利用Peakfit軟件對(duì)處理前后TM樣品的紅外光譜原始圖進(jìn)行去卷積、二階導(dǎo)數(shù)處理，使擬合殘差R2不小于0.990，根據(jù)子吸收峰的積分面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。利用Spectrum軟件對(duì)植物乳桿菌處理TM前后的紅外光譜原始圖進(jìn)行基線校正，13 點(diǎn)平滑及歸一化處理，獲得樣品的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 TM的提取和富集

Lehrer等[21]研究報(bào)道TM分子質(zhì)量在32～38 kDa之間。如圖1所示，對(duì)比各樣品條帶可以明顯看到，相較于未經(jīng)處理的提取液樣品1，煮沸后的樣品2和硫酸銨處理透析后的樣品5位于35.0 kDa附近的條帶很粗。由此可見，煮沸和硫酸銨處理可以有效富集南美白對(duì)蝦中的TM蛋白質(zhì)，富集后的提取液中TM含量較多，純度較高，可以滿足實(shí)驗(yàn)需求。

圖1 南美白對(duì)蝦的TM提取液和富集處理樣品的SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of crude and enriched TM extracts of P.vannamei

2.2 提取物對(duì)TM含量及免疫活性的影響

SDS-PAGE能夠從電泳條帶的寬窄及顏色深淺中判斷不同成分提取物對(duì)TM含量及濃度的影響。蛋白免疫印跡和競(jìng)爭(zhēng)ELISA利用抗原抗體的特異性反應(yīng)，評(píng)價(jià)不同成分提取物對(duì)TM免疫活性的改變。

從圖2可以看出，與TM對(duì)照樣品（C）相比，經(jīng)植物乳桿菌菌體及其不同成分提取物水解TM 12 h后，35 kDa附近條帶均明顯變窄變淺或消失，水解48 h的TM產(chǎn)物條帶均肉眼不可見（圖2a），由此可見TM含量明顯減少，其中，部分產(chǎn)物與5G5E有2 個(gè)反應(yīng)條帶，其原因很可能是TM蛋白在植物乳桿菌的作用下發(fā)生部分水解造成的。與此相對(duì)應(yīng)的，不同處理的植物乳桿菌水解TM后的產(chǎn)物與TM特異性單克隆抗體5G5E的免疫反應(yīng)條帶隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)明顯減弱，免疫印跡結(jié)果顯示這2 個(gè)條帶均可與5G5E發(fā)生特異性反應(yīng)，表明植物乳桿菌的水解雖然可破壞TM蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，但其抗原表位并未被完全破壞，因此水解產(chǎn)物仍會(huì)與5G5E抗體發(fā)生反應(yīng)（圖2b）。此外，SDS-PAGE和免疫印跡結(jié)果顯示，菌體胞內(nèi)酶及破碎內(nèi)容物水解TM 24 h，TM條帶幾乎不可見，而菌體碎片水解TM 36 h，TM條帶及其與5G5E抗體的免疫反應(yīng)條帶仍清晰可見，說明菌體胞內(nèi)酶及破碎內(nèi)容物的水解效果明顯優(yōu)于菌體碎片；去除菌體表面的蛋白質(zhì)、脂肪、脂磷壁酸或?qū)Ⅳ然セ?，?2 h的水解產(chǎn)物條帶與5G5E的結(jié)合能力無顯著差異，表明這幾種處理的植物乳桿菌對(duì)TM蛋白的水解能力無明顯差別。然而，菌體表面經(jīng)氨基甲基化處理后，水解TM 24 h的產(chǎn)物依然存在與5G5E抗體的免疫反應(yīng)條帶，表明氨基甲基化后的菌體對(duì)TM免疫活性的消減能力明顯減弱，這與SDS-PAGE結(jié)果一致。

圖2 植物乳桿菌不同成分提取物的TM水解產(chǎn)物的SDS-PAGE和蛋白免疫印跡Fig.2 SDS-PAGE and Western blot results of TM hydrolysates obtained by treatment with different L.plantarum materials

為進(jìn)一步定量分析植物乳桿菌及其不同成分提取物對(duì)TM免疫活性的影響作用，本研究采用競(jìng)爭(zhēng)性ELISA評(píng)價(jià)菌體及各提取物對(duì)TM免疫活性的降低程度。由圖3可知，水解反應(yīng)12 h后，菌體碎片和氨基甲基化菌體對(duì)免疫活性消減率最低，分別為21.1%和18.5%，其他成分提取物和菌體樣品對(duì)TM免疫活性消減效果差別不大，消減率均在31.8%～37.1%之間；水解反應(yīng)48 h后，菌體及其不同成分提取物對(duì)TM免疫活性的消減率均大于60%，其中菌體對(duì)免疫活性的消減效果最佳，達(dá)76.9%，菌體碎片及氨基甲基化菌體消減效果最差，消減率分別為60.7%和61.7%。消減率越高，TM的免疫活性越弱，說明該成分提取物對(duì)TM免疫活性的消減效果最佳，反之亦然。

圖3 植物乳桿菌不同成分提取物對(duì)TM免疫活性的消減效果Fig.3 Reduction effect of different L.plantarum materials on TM immune activity

由此可見，SDS-PAGE、蛋白免疫印跡和ELISA結(jié)果均顯示，不同處理的植物乳桿菌對(duì)TM免疫活性的影響具有顯著差異，將菌體破碎或?qū)⑵浒被谆?，其?duì)TM免疫活性的消減能力明顯下降，其原因很可能是它們?cè)谒釺M的過程中，會(huì)不同程度地破壞TM蛋白的空間結(jié)構(gòu)及其抗原表位。

2.3 植物乳桿菌不同成分提取物對(duì)TM二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)紅外光譜酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）的特征振動(dòng)頻率主要取決于其氨基酸殘基的C＝O和N—H之間的氫鍵性質(zhì)，它可以反映多肽或蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲等結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的信息（1 610～1 640 cm-1特征β-折疊；1 640～1 650 cm-1特征無規(guī)卷曲；1 650～1 658 cm-1特征α-螺旋；1 660～1 700 cm-1特征β-轉(zhuǎn)角[22-23]）。SDS-PAGE和免疫印跡結(jié)果顯示植物乳桿菌的不同成分提取物對(duì)TM免疫活性的影響具有顯著差異，其中破碎菌體和氨基甲基化后的菌體對(duì)TM免疫活性的消減能力明顯減弱（圖2）。為進(jìn)一步解析植物乳桿菌對(duì)TM免疫活性的消減作用，采用紅外光譜技術(shù)分析了植物乳桿菌不同成分提取物對(duì)TM二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響作用。

由圖4可知，TM對(duì)照樣品的α-螺旋相對(duì)含量最高，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)次之，分別為71.7%、15.2%，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[24]。研究發(fā)現(xiàn)，菌體水解TM后其α-螺旋相對(duì)含量最少，為15.4%，下降了56.3%，解旋率高于其他成分提取物，α-螺旋大部分解旋為β-折疊，β-折疊相對(duì)含量增加了26.2%。與之相反，菌體碎片和氨基甲基化菌體水解TM的產(chǎn)物，其α-螺旋相對(duì)含量分別為23.7%和21.2%，解旋率低于其他成分提取物，β-折疊相對(duì)含量分別為17%和19.2%，也明顯低于其他成分的TM水解產(chǎn)物。潘迪[25]利用超高壓協(xié)同轉(zhuǎn)谷氨酞胺酶處理花生致敏蛋白Ara h 1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著壓力增加，Ara h 1的α-螺旋相對(duì)含量明顯減少，β-折疊相對(duì)含量增多，Ara h 1二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化影響其致敏性。由此可見，植物乳桿菌會(huì)較大程度破壞TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)，大部分α-螺旋解旋為β-折疊，TM結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步折疊化導(dǎo)致暴露的抗原表位被包埋，減少了與抗體結(jié)合的機(jī)會(huì)，從而降低了TM蛋白的免疫活性。而菌體碎片和氨基甲基化菌體對(duì)TMα-螺旋結(jié)構(gòu)的破壞最小，且TM的折疊化結(jié)構(gòu)較少，因而相較于其他成分提取物，增加了處理產(chǎn)物與免疫位點(diǎn)的特異性結(jié)合機(jī)會(huì)，表現(xiàn)為菌體碎片和氨基甲基化菌體對(duì)TM的免疫活性消減率最低（圖3）。

圖4 植物乳桿菌不同成分提取物水解前后TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量Fig.4 Relative contents of secondary structures in TM before and after hydrolysis by different L.plantarum materials

2.4 植物乳桿菌不同成分提取物對(duì)TM致敏表位的影響

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，TM經(jīng)體外模擬胃液消化2 h后，其消化產(chǎn)物中存在3 個(gè)抗消化性能強(qiáng)的抗原表位Epitope l（TKLAEASQAADESER）、Epitope 2（DEERM）和Epitope 3（FLAEEADRK），這3 個(gè)抗原表位很可能是TM的關(guān)鍵致敏表位[26]。為進(jìn)一步分析植物乳桿菌不同成分提取物對(duì)TM致敏表位的影響，以3 個(gè)合成表位與血藍(lán)蛋白的偶聯(lián)物作為抗原免疫BALB/c小鼠，制備這3 種表位的多克隆抗體，通過間接ELISA分析植物乳桿菌不同成分提取物的TM水解產(chǎn)物與這3 個(gè)致敏表位間的特異性反應(yīng)情況。

將致敏表位的抗血清從100 倍梯度稀釋至1 600 倍，ELISA結(jié)果顯示隨著小鼠血清稀釋倍數(shù)的增加，小鼠血清與合成表位反應(yīng)的OD值逐漸降低，表明這3 種致敏表位的多克隆抗體與Epitope 1、Epitope 2、Epitope 3具有特異性反應(yīng)（圖5）。

圖5 3 種表位抗體效價(jià)結(jié)果Fig.5 Titers of three epitope antibodies

由圖6可知，菌體水解TM后其產(chǎn)物與PAb-Epitope l、PAb-Epitope 2、PAb-Epitope 3的結(jié)合反應(yīng)變化率均高于其他成分提取物的水解產(chǎn)物，分別下降了70.3%、30.7%、54.3%；菌體碎片與氨基甲基化菌體的水解產(chǎn)物與3 個(gè)表位抗體的結(jié)合反應(yīng)變化率均明顯低于其他成分提取物，其中與PAb-Epitope l的結(jié)合反應(yīng)下降最為顯著，分別為48.1%、46.1%，其次是與PAb-Epitope 3的結(jié)合反應(yīng)（27.3%、23.9%），而與PAb-Epitope 2的結(jié)合反應(yīng)分變化率最低（6.5%、5.4%）。變化率越大表示水解產(chǎn)物與表位抗體間的結(jié)合能力越弱，表明該成分提取物對(duì)TM的免疫活性影響越大，反之亦然。

圖6 植物乳桿菌不同成分提取物水解后TM蛋白與表位抗體結(jié)合反應(yīng)變化情況Fig.6 Change in binding reaction between TM hydrolysates obtained by treatment with different L.plantarum materials and epitope antibodies

Ruan Weiwei等[27]研究了美拉德反應(yīng)對(duì)擬穴青蟹中TM以及精氨酸激酶的致敏性影響，發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)可以使易消化抗原表位大量消失，且對(duì)具有抗消化能力的抗原部分具有一定破壞性，從而降低其致敏性；Fu Linglin等[28]研究發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)可以消除一部分表位的過敏性，進(jìn)而影響TM蛋白的致敏性。結(jié)合二級(jí)結(jié)構(gòu)變化結(jié)果，認(rèn)為菌體碎片、氨基甲基化菌體的TM水解產(chǎn)物與3 個(gè)表位抗體的結(jié)合反應(yīng)變化率顯著低于其他成分提取物，其原因很可能是兩者對(duì)TM的這3 種致敏表位的破壞程度較小。此外，發(fā)現(xiàn)所有成分對(duì)Epitope 2抗體的結(jié)合反應(yīng)變化率顯著低于Epitope 1和Epitope 3，這可能是因?yàn)镋pitope 1與Epitope 3氨基酸序列中的賴氨酸及谷氨酸在植物乳桿菌水解TM的過程中會(huì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)[25]，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，增加了表位的破壞程度。

2.5 植物乳桿菌對(duì)TM的消減作用位點(diǎn)分析

不同處理植物乳桿菌的TM水解產(chǎn)物的免疫學(xué)分析以及TM二級(jí)結(jié)構(gòu)變化數(shù)據(jù)顯示，菌體對(duì)TM蛋白空間結(jié)構(gòu)及致敏表位破壞程度最大，菌體碎片和氨基甲基化菌體破壞程度最小，其他幾種處理菌體對(duì)TM結(jié)構(gòu)及表位的破壞程度無較大差別（圖3、4）。為了解析植物乳桿菌對(duì)TM免疫活性的可能消減作用位點(diǎn)，選取菌體、羧基酯化菌體、菌體碎片和氨基甲基化菌體及其TM水解產(chǎn)物的樣品進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析。對(duì)比分析各成分提取物及其TM水解產(chǎn)物的二階導(dǎo)數(shù)譜圖，發(fā)現(xiàn)譜圖變化主要集中在1 800～1 500 cm-1范圍（圖7）。各成分提取物水解TM前后的峰形大致保持不變，但其中一部分峰形變得明顯尖銳，峰面積也明顯增大。

圖7 植物乳桿菌不同成分提取物及TM消減產(chǎn)物的傅里葉變換紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)譜圖Fig.7 FT-IR secondary derivative spectra of TM treated with different L.plantarum materials

由表1可知，各提取物在水解TM后，紅外譜圖吸收峰變化集中在C＝O引起的伸縮振動(dòng)吸收峰、N—H鍵引起的彎曲或變角振動(dòng)吸收峰。其中菌體的TM水解產(chǎn)物有N—H鍵引起的5 個(gè)變角振動(dòng)吸收峰（（1 648±1）、（1 641±1）、（1 630±1）、（1 624±1）、1 613 cm-1）、3 個(gè)彎曲振動(dòng)吸收峰（1 659、（1 540±1）、（1 534±1） cm-1）、2 個(gè)面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰（（1 559±1）、1 696 cm-1）和C＝O引起的3 個(gè)伸縮振動(dòng)吸收峰（（1 773±1）、1 724、（1 711±1）cm-1）的峰形或峰面積發(fā)生了變化。與菌體相比，羧基酯化菌體的TM水解產(chǎn)物有N—H鍵引起的3 個(gè)彎曲振動(dòng)吸收峰（1 659、1 541、1 535 cm-1）、2 個(gè)面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰（（1 558±1）、1 695 cm-1）、2 個(gè)變角振動(dòng)吸收峰（（1 648±1）、（1 630±1）cm-1）和C＝O引起的2 個(gè)伸縮振動(dòng)吸收峰（1 773、（1 723±1）cm-1）的峰形或峰面積發(fā)生了變化；菌體碎片水解產(chǎn)物有N—H鍵引起的3 個(gè)彎曲振動(dòng)吸收峰（1 658、（1 540±1）、（1 530±1）cm-1）、3 個(gè)變角振動(dòng)吸收峰（（1 648±1）、1 631、（1 618±1）cm-1）和C＝O引起的1 個(gè)伸縮振動(dòng)吸收峰（（1 773±1）cm-1）的峰形或峰面積發(fā)生了變化；氨基甲基化菌體的水解產(chǎn)物有N—H鍵引起的2 個(gè)變角振動(dòng)吸收峰（1 668、1 648 cm-1）、1 個(gè)面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰（1 700 cm-1）和C＝O引起的1 個(gè)伸縮振動(dòng)吸收峰（（1 717±1）cm-1）的峰形或峰面積發(fā)生了變化。比較發(fā)現(xiàn)，各提取物及其TM水解產(chǎn)物的紅外譜圖主要是N—H鍵的振動(dòng)吸收峰發(fā)生了變化，其中菌體的3 個(gè)N—H鍵特征峰變化數(shù)量最多（10 個(gè)），其次是羧基酯化菌體（7 個(gè)）和菌體碎片（6 個(gè)）；而氨基甲基化菌體的3 個(gè)N—H鍵特征峰的變化數(shù)量最少，僅為3 個(gè)（1 700、1 668、1 648 cm-1），且菌體碎片和氨基甲基化菌體的變化強(qiáng)度均小于菌體和羧基酯化菌體。結(jié)合免疫學(xué)分析結(jié)果，推測(cè)，氨基很可能是植物乳桿菌消減TM免疫活性的一個(gè)重要作用位點(diǎn)。

表1 植物乳桿菌不同成分提取物及TM水解產(chǎn)物的傅里葉變換紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)譜圖分析Table 1 FT-IR secondary derivative spectral analysis of TM hydrolyzed by different L.plantarum materials

3 結(jié) 論

本研究通過對(duì)比分析植物乳桿菌菌體和各種不同成分提取物對(duì)TM免疫活性的影響作用和作用方式，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌會(huì)較大程度地改變TM的二級(jí)結(jié)構(gòu)并破壞其致敏表位，其中氨基甲基化菌體和菌體碎片對(duì)TM的α-螺旋結(jié)構(gòu)和致敏表位的破壞最小，且TM的折疊化結(jié)構(gòu)較少，因而對(duì)TM的免疫活性消減率最低。此外，研究發(fā)現(xiàn)氨基很可能是植物乳桿菌消減TM免疫活性的一個(gè)重要作用位點(diǎn)。本研究可為今后食物過敏原的活性控制以及低致敏性水產(chǎn)加工制品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。