Stathmin在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及意義

石英 翁艷潔 周文娟 周婷 陳剛 王常玉

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢 430030

卵巢癌是一種常見的嚴(yán)重威脅婦女生命健康的惡性疾病, 發(fā)病率僅次于宮頸癌和乳腺癌。由于缺乏有效的早期診斷篩選手段，且早期無(wú)明顯癥狀，70%的患者就診時(shí)已為晚期，其中上皮性卵巢癌占卵巢惡性腫瘤的85%～90%。雖然治療方法不斷改進(jìn)，但預(yù)后仍較差，5年生存率無(wú)明顯改善［1］。有研究證據(jù)表明，卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展是多因素、多階段的過(guò)程，涉及多個(gè)基因的變化，因此發(fā)現(xiàn)新的腫瘤基因治療靶點(diǎn)，逐漸成為卵巢癌研究的熱點(diǎn)。

Stathmin又稱Op18 (Oncoprotein 18)，是一種重要的微管不穩(wěn)定蛋白，通過(guò)磷酸化和去磷酸化作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞微管系統(tǒng)的動(dòng)力學(xué)平衡與穩(wěn)定，控制細(xì)胞周期，并參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)行為［2］。去磷酸化的Stathmin可以將Tubulin分離成無(wú)功能的可溶性T2S復(fù)合體，使微管末端附近可利用的Tubulin數(shù)量減少，促進(jìn)微管解聚，調(diào)節(jié)微管的解聚和組裝。同時(shí)，Stathmin參與調(diào)節(jié)細(xì)胞有絲分裂，特別是紡錘體形成。有絲分裂間期，非磷酸化Stathmin促進(jìn)微管解聚，為有絲分裂期紡錘體生成奠定基礎(chǔ)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期，Stathmin主要以磷酸化形式存在，促解聚活性喪失，微管聚合，利于紡錘體形成；而在有絲分裂晚期，Stathmin又通過(guò)去磷酸化激活，促進(jìn)紡錘體解聚，順利完成有絲分裂［3］。既往研究發(fā)現(xiàn)Stathmin在肺癌［4］、肝癌［5］、宮頸癌［6］等多種腫瘤中異常高表達(dá)，提示Stathmin可能參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，但具體機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過(guò)檢測(cè)Stathmin在正常卵巢上皮、卵巢良性腫瘤和上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)并分析其與臨床病理特征的關(guān)系，為卵巢癌的臨床靶向基因治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

收集武漢同濟(jì)醫(yī)院2008年12月—2010年10月行手術(shù)治療并經(jīng)病理證實(shí)的卵巢組織標(biāo)本。其中卵巢良性腫瘤16例，上皮性卵巢癌50例(漿液性囊腺癌33 例，黏液性囊腺癌12例，子宮內(nèi)膜樣腺癌5例)，并以22例因?qū)m頸癌手術(shù)行附件切除的正常卵巢作為對(duì)照。新鮮標(biāo)本分兩部分，一部分置RNA Later液保存于-80 ℃冰箱中用于RNA提取及RT-PCR，另一部分用4%多聚甲醛固定后交武漢谷歌生物公司石蠟包埋切片后用于免疫組化。

1.2 主要試劑

組織RNA提取試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司，RT-PCR相關(guān)試劑購(gòu)于北京全式金公司，SABC法兔抗免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司，Stathmin兔抗人抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 免疫組化方法及結(jié)果判定

所有標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定，石蠟包埋連續(xù)切片后，按SABC法免疫組化試劑盒步驟進(jìn)行。結(jié)果判定參照Sulzers分級(jí)法。按著色強(qiáng)度分4級(jí)：無(wú)陽(yáng)性著色為0分；淺黃色陽(yáng)性顆粒為1分；棕黃色陽(yáng)性顆粒為2分；棕褐色陽(yáng)性顆粒為3分。按著色范圍分4級(jí)。Ⅰ級(jí)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞著色為0分；Ⅱ級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞率≤25%為1分；Ⅲ級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞率為26%～50%為2分；Ⅳ級(jí)：陽(yáng)性細(xì)胞率≥51%為3分。隨機(jī)觀察5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞的陽(yáng)性率，求平均值。染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為著色強(qiáng)度與范圍之積：0分為陰性(-)，1～2分陽(yáng)性(+)，3～6分中度陽(yáng)性(++)，7～9分強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。分析結(jié)果時(shí)，≤2分為陰性，>2分為陽(yáng)性。

1.4 組織RNA提取及RT-PCR

組織RNA提取依照TIANGEN RNAprep pure微量RNA提取試劑盒步驟進(jìn)行。引物由上海Invitrogen公司合成，Stathmin上游引物為5’-TGAAAGACGCAAGTCCCAT-3’，下游引物5’-GGTAGCCCCTAAAACAACAT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為444 bp；GAPDH上游引物5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，下游引物為5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為238 bp。循環(huán)參數(shù)設(shè)為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進(jìn)行33個(gè)循環(huán)擴(kuò)增，72 ℃終延伸10 min，4 ℃ 保存。各樣本PCR產(chǎn)物通過(guò)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，應(yīng)用凝膠成像掃描及分析系統(tǒng), 用各樣本的目的基因條帶灰度值與相應(yīng)GAPDH條帶灰度值相比，求其比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RT-PCR方法檢測(cè)Stathmin mRNA在不同卵巢組織中的表達(dá)

各組PCR產(chǎn)物分別在444 bp及238 bp處見條帶(圖1)。分析后得出Stathmin mRNA在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)(1.608±0.121)明顯高于卵巢良性腫瘤(0.394±0.049)及正常卵巢上皮(0.537±0.068)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 免疫組化法檢測(cè)

Stathmin蛋白在不同卵巢組織中均表達(dá)。Stathmin蛋白表達(dá)陽(yáng)性信號(hào)定位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，呈淺黃、棕黃、棕褐色陽(yáng)性顆粒。與正常卵巢組［9.09%(2/22)］、良性卵巢腫瘤組［31.25%(5/16)］相比，上皮性卵巢癌組的陽(yáng)性表達(dá)率(74.00%，37/50)明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.91，P<0.01；χ2=9.57，P<0.01)，而正常卵巢組與良性卵巢腫瘤組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

2.3 Stathmin蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Stathmin蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌的臨床分期、組織分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與年齡、病理類型及腹水量無(wú)相關(guān)性(表1)。

表1 Stathmin蛋白表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between Stathmin protein expression and clinicopathological characteristics in epithelial ovarian cancer

3 討 論

尋找特異性的標(biāo)志物已成為卵巢癌診斷和病情監(jiān)測(cè)的拓展領(lǐng)域之一。許多標(biāo)志物包括CA125、CA72-4、CA199和AFP等已被廣泛應(yīng)用于臨床，但靈敏度和特異度不高。因此不斷尋找新的標(biāo)志物并聯(lián)合檢測(cè)將更有效地應(yīng)對(duì)卵巢癌的異質(zhì)性。

Stathmin作為一種與細(xì)胞周期相關(guān)的微管調(diào)節(jié)蛋白，最初被發(fā)現(xiàn)在惡性淋巴瘤細(xì)胞中高表達(dá)，隨后證實(shí)在多種腫瘤中異常高表達(dá)，提示Stathmin可能參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Stathmin表達(dá)與正常細(xì)胞的增殖相關(guān)，但存在組織差異性。研究發(fā)現(xiàn)Stathmin在低分化肺癌和乳腺癌中高表達(dá)，推測(cè)Stahtmin可能與腫瘤細(xì)胞的過(guò)度增殖和分化不良相關(guān)［7-8］。Stathmin作為一種傳遞細(xì)胞外信號(hào)的細(xì)胞質(zhì)磷蛋白，可與多種細(xì)胞因子、癌基因或抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物相互作用，引起細(xì)胞內(nèi)一系列生物學(xué)改變［3,9］。其中，野生型p53基因可通過(guò)抑制 Stathmin基因啟動(dòng)子活性來(lái)參與Stathmin表達(dá)的負(fù)性調(diào)節(jié)，而Stathmin持續(xù)高表達(dá)會(huì)越過(guò)p53介導(dǎo)的G2/M期阻滯，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與分化［10］。

本研究通過(guò)RT-PCR及免疫組化方法檢測(cè)Stathmin在卵巢癌組織中的表達(dá)，從基因和蛋白水平驗(yàn)證了Stathmin在正常卵巢上皮及腫瘤組織中均有表達(dá)，且在上皮性卵巢癌中表達(dá)明顯升高；同時(shí)探討了Stathmin與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Stathmin的異常高表達(dá)與卵巢癌臨床分期、病理分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)，即Stathmin在晚期低分化及伴淋巴轉(zhuǎn)移的癌組織中異常高表達(dá)，與 Price等［11］的研究結(jié)論一致，提示Stathmin與卵巢癌的分化不良有關(guān)，并可能參與卵巢癌的淋巴轉(zhuǎn)移。Trovik等［12］報(bào)道，Stathmin在子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中表達(dá)增高，并作為一種PI3K激酶抑制因子，促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的淋巴轉(zhuǎn)移。另外，研究組前期通過(guò)二維電泳聯(lián)合質(zhì)譜分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)對(duì)順鉑敏感性不同的兩種卵巢癌細(xì)胞株之間存在多種差異表達(dá)蛋白，Stathmin即為其中之一，推測(cè)其可能在卵巢癌鉑類耐藥中發(fā)揮一定作用。

以上研究為探索Stahtmin在卵巢癌中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，下一步將完善實(shí)驗(yàn)思路：在體外，干預(yù)Stathmin的表達(dá)及功能，觀察對(duì)卵巢癌細(xì)胞株化療敏感性及侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的影響；在體內(nèi)，選擇適當(dāng)?shù)哪Ｊ絼?dòng)物建立卵巢癌模型，尋找特異性的靶向藥物，有效致力于卵巢癌的臨床治療。

綜上所述，Stathmin在卵巢癌組織中異常高表達(dá)，可能與卵巢癌的分化不良、淋巴轉(zhuǎn)移及化療耐藥相關(guān)。Stathmin將可能成為卵巢癌新的標(biāo)志物之一，并作為新靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床。

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