冰淇淋檢驗(yàn)中大腸菌群MPN計數(shù)法不確定度的評定

郜杏麗

一切測量結(jié)果都不可避免的具有不確定度，廣義而言，測量不確定度意為對測量結(jié)果正確性的可疑程度。測量過程中的隨機(jī)效應(yīng)和系統(tǒng)效應(yīng)均會導(dǎo)致測量不確定度，數(shù)據(jù)處理中的修約也會導(dǎo)致不確定度，測量不確定度是評定測量水平的指標(biāo)，是判定測量結(jié)果質(zhì)量的依據(jù)，大腸菌群的檢測也不例外。大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，該菌主要來源于人畜糞便故以此作為糞便污染指標(biāo)來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中是否有腸道致病菌的可能，本文根據(jù)CNAS-GL05：2006《測量不確定度要求的實(shí)施指南》、JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》和GB4789.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計數(shù)》對同一份冰淇淋中大腸菌群同時檢測15次的結(jié)果作不確定度的評定。

1 評定方法

1.1 檢測過程 依據(jù)GB4789.3-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計數(shù)》以無菌吸管吸取25 ml溶化的冰淇淋置盛有225 ml生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。調(diào)節(jié)pH在6.5～7.5之間。用1 ml無菌吸管吸取1∶10的樣品勻液1 ml，沿管壁緩緩注入9 ml生理鹽水的無菌試管中，振搖試管，使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋1次，換用一支1 ml無菌吸管。選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯，每管接種1 ml，36℃ ±1℃培養(yǎng)24 h±2 h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24 h±2 h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48 h±2 h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36℃ ±1℃培養(yǎng)48 h±2 h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。根據(jù)確證的大腸菌群LST陽性管數(shù)，檢索MPN表，報告每毫升樣品中大腸菌群MPN值。

1.2 不確定度的來源分析 檢驗(yàn)步驟主要包括樣品取樣、稀釋、檢測、培養(yǎng)等。由于結(jié)果的散發(fā)性較大這一特點(diǎn)，我們只對稱量、稀釋、及重復(fù)檢測引起的不確定度進(jìn)行分析量化。主要有以下幾個分量：

Ua稱量引起的不確定度;

Ub稀釋引起的不確定度;

Un重復(fù)檢測結(jié)果引起的不確定度。

1.3 建立數(shù)學(xué)模型

式中：

A-樣品中大腸菌群數(shù)，MPN/ml;

N-查表得到的大腸菌群數(shù)，MPN/ml;

V-稀釋倍數(shù)。

1.4 不確定度分量評定

1.4.1 取樣產(chǎn)生的不確定度Ua根據(jù)常用玻璃量器檢定規(guī)程，25 ml刻度吸管允許誤差為±0.200 ml，按均勻分布計算屬B類不確定度。

0.200÷√3=0.116 ml，樣品實(shí)際吸取 25 ml，Ua=0.116÷25=0.0046。

1.4.2 稀釋引起的不確定度Ub根據(jù)常用玻璃量器檢定規(guī)程250 ml量筒允許誤差為±2.0 ml。10 ml刻度吸管允許誤差為±0.05 ml。1 ml刻度吸管允許誤差為±0.008 ml。按均勻分布計算屬B類不確定度。

250 ml量筒：2.0 ml÷√3=1.156 ml稀釋液實(shí)際量取225 ml

Ub1=1.156 ml÷225 ml=0.00514

10 ml刻度吸管：0.05 ml÷√3=0.028 ml

Ub2=0.028÷10 ml=0.0028

1 ml刻度吸管：0.008 ml÷√3=0.0046 ml

Ub3=0.0046 ml÷1 ml=0.0046

以上三項(xiàng)合成得出：

Ub=√0.005142+0.00282+0.00462=0.0074

1.4.3 重復(fù)性檢測引起的不確定度Un

同一個樣品重復(fù)檢測15次所得的大腸菌群結(jié)果差異所引起的不確定度，屬A類不確定度，由于大腸菌群的生長繁殖是以幾何級數(shù)遞增的，所以結(jié)果的發(fā)散性較大，應(yīng)用貝塞爾公式計算標(biāo)準(zhǔn)差時才用取對數(shù)的方法，見表1。

檢測結(jié)果平均值為7.793±lgX平均值為0.878±±S=0.119±±即Un=0.1190

1.5 合成不確定度Uc

Uc=√Ua2+Ub2+Un2=√0.00462+0.00742+0.11902=0.1193

1.6 擴(kuò)展不確定度U 取置信水平P=0.95，自由度r=14，查 t分布表得;t95(14)=2.145，則擴(kuò)展不確定度：U=2.145 0.1193=0.2559

表1 同一樣品15次檢測結(jié)果每ml大腸菌群MPN值

2 結(jié)果

通過本次實(shí)驗(yàn)所得的擴(kuò)展不確定度推算出大腸菌群的對數(shù)值范圍為0.878±0.2559，即0.6221～1.1339，取反對數(shù)后，樣品中大腸菌群含量的取值范圍為4.189～13.611 mPN/ml。而忽略B類不確定度，僅由重復(fù)檢測引入的不確定度所得的擴(kuò)展不確定度U*=2.145 0.1190=0.2553，大腸菌群的對數(shù)值范圍為0.878±0.2553，即0.6227～1.1333，取反對數(shù)后，樣品中大腸菌群含量的取值范圍為4.195～13.593 mPN/ml。兩者結(jié)果幾乎相同，若保留小數(shù)點(diǎn)后一位小數(shù)，則兩者均為4.2～13.6。

3 討論

根據(jù)CNAS-GL05：2006《測量不確定度要求的實(shí)施指南》對那些比最大分量的三分之一還小的分量不必仔細(xì)評估。通常只需對其估計一個上限即可，重點(diǎn)應(yīng)放在識別并仔細(xì)評估那些重要的分量特別是占支配地位的分量上。從本次試驗(yàn)結(jié)果來看，重復(fù)性檢測引入的不確定度是占支配地位的重要分量，而稱量引入的不確定度Ua/重復(fù)檢測結(jié)果引起的不確定度Un=0.039，稀釋引起的不確定度Ub/重復(fù)檢測結(jié)果引起的不確定度Un=0.062，均＜0.33，因此由稱量和稀釋引入的不確定度與重復(fù)性檢測引入的不確定度相比是極次要的分量，可以忽略不計。所以對冰淇淋檢驗(yàn)中大腸菌群不確定度的評定，相對來說就簡單易行了，日常工作中我們只需要考慮重復(fù)檢測所引起入的不確定度。本方法適用于同類樣品大腸菌群MPN計數(shù)法檢測中的不確定度評定。

［1］JJF1059-1999.測量不確定度評定與表示.

［2］cANS-CL07.測量不確定度評估和報告通用要求.

［3］gB4789.3-2010.食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計數(shù).