國(guó)產(chǎn)與進(jìn)口地塞米松棕櫚酸酯注射液的人體生物等效性研究

朱艷榮，周倫，丁莉坤，趙培西，常瑛，馮娟，王婧雯，文愛(ài)東（第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院藥劑科，西安市710032）

地塞米松棕櫚酸酯（Dexamethasone palmitate）為長(zhǎng)效糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥，具有抗炎、抗過(guò)敏、抗休克及抗毒等作用，臨床上可用于自身免疫性疾病、過(guò)敏性疾病、血液系統(tǒng)疾等的治療[1]。制劑中以卵磷脂作乳化劑，將地塞米松棕櫚酸酯溶解于乳糜微粒中，進(jìn)入體內(nèi)，乳糜微粒被巨噬細(xì)胞吞噬，使藥物在病灶部位濃集；另一方面，地塞米松棕櫚酸酯是由地塞米松與棕櫚酸經(jīng)酯化反應(yīng)制得，在體內(nèi)經(jīng)酯酶作用緩慢水解，釋放出活性物質(zhì)地塞米松，從而起到持久的消炎作用和免疫抑制作用。在本研究中，筆者采用液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）法測(cè)定人血漿中地塞米松棕櫚酸酯和地塞米松的濃度，并將其應(yīng)用于人體藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究中。

1 材料

1.1 儀器

1200液相色譜儀，包括真空脫氣機(jī)、二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱（美國(guó)Agilent公司）；6410三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，包括MassHunter工作站（美國(guó)Agilent公司）；TDL80-2B低速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；XW-80A渦旋儀（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司）；TGL-16C高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）

1.2 試藥

地塞米松對(duì)照品（批號(hào)：0129-9702）、潑尼松對(duì)照品（內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：0199-9401）均為中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；受試制劑：地塞米松棕櫚酸酯注射液（西安力邦制藥有限公司，規(guī)格：每支5 mg或10 mg，批號(hào)：070501）；參比制劑：地塞米松棕櫚酸酯注射液（日本三菱制藥株式會(huì)社，批號(hào)：P015）。甲醇為色譜純，乙酸銨、二氯甲烷為分析純；試驗(yàn)用水為去離子水。

2 方法[2]與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Akasil C8（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-10 mmol·L－1醋酸銨溶液（93.5∶6.5）；流量：1 mL·min－1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

檢測(cè)方式：氣動(dòng)輔助電噴霧離子化（ESI）；離子極性：正離子；離子檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；地塞米松棕櫚酸酯：m/z631.4→373.3，碰撞能：25 eV，裂解電壓：110 V；地塞米松：m/z393.3→147.3，碰撞能：25 eV，裂解電壓：90 V；潑尼松：m/z359.3→147.2，碰撞能：25 eV，裂解電壓：110 V。

2.2 研究對(duì)象選擇

20名健康受試者被納入試驗(yàn)。經(jīng)體檢證明肝、腎功能、心電圖、血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化檢查均無(wú)異常后簽署知情同意書(shū)。試驗(yàn)前2周及試驗(yàn)期間未服用任何其他藥物。試驗(yàn)期間統(tǒng)一飲食。

2.3 劑量分組及給藥方案

采用標(biāo)準(zhǔn)二階段交叉設(shè)計(jì)（Two-period Crossover Design）自身對(duì)照試驗(yàn)方法，將20例受試者隨機(jī)分為A、B組，第1階段A組靜脈注射受試制劑，B組靜脈注射參比制劑，劑量均為單劑量靜脈注射1 mL（4 mg）；經(jīng)清洗期1周后2組交換給藥品種進(jìn)行第2階段試驗(yàn)。試驗(yàn)期間禁止劇烈活動(dòng)，禁止吸煙、飲酒或含藥物、酒精的飲料等。每次試驗(yàn)前1天19∶00后即禁食。靜脈注射藥物前抽取空白血樣5 mL，在給藥后5、10、20、30 min及1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h時(shí)分別采靜脈血5 mL置無(wú)菌肝素抗凝試管中，離心分離出血漿置無(wú)菌試管中，于－20℃保存，待測(cè)。

2.4 血漿樣品的測(cè)定

2.4.1 血樣處理：取含藥血漿樣品1 mL，加入內(nèi)標(biāo)（1 μg·mL－1潑尼松）溶液50 μL，渦旋混勻，再加入乙醚5 mL，渦旋3 min，于4 000 r·min－1離心10 min。取上清液于另一離心管中，于30℃水浴中氮?dú)饬鞔蹈?，流?dòng)相120 μL復(fù)溶。16 000 r·min－1離心3 min，取上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣分析。

2.4.2 特異性考察：在本試驗(yàn)所采用的色、質(zhì)譜條件下，地塞米松、地塞米松棕櫚酸酯、內(nèi)標(biāo)潑尼松的出峰時(shí)間分別為2.29、4.6、2.26 min。地塞米松棕櫚酸酯、地塞米松和內(nèi)標(biāo)峰形良好，無(wú)雜峰干擾測(cè)定，表明本方法具有較高的特異性，靈敏度較高。液-質(zhì)聯(lián)用圖譜見(jiàn)圖1。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：取10 mL塑料離心管數(shù)支，加入空白血漿1 mL，再分別加入不同量的地塞米松棕櫚酸酯、地塞米松標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成濃度分別為5.32、10.64、31.92、106.4、319.2、1 596 ng·mL－1的地塞米松棕櫚酸酯以及 2.138、5.345、10.69、32.07、106.9、320.7 ng·mL－1的地塞米松含藥血漿，并按“2.4.1”項(xiàng)下方法操作，復(fù)溶后吸取上清液轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，進(jìn)行分析。記錄色譜圖，分別記錄地塞米松棕櫚酸酯、地塞米松的峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai，計(jì)算峰面積的比值f（f＝As/Ai），將f對(duì)濃度（c）作權(quán)重回歸，得地塞米松棕櫚酸酯、地塞米松標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程分別為：f＝0.008 156c－0.015 261（r＝0.999 0）、f＝0.016 16c－0.008 24（r＝0.999 0）。結(jié)果表明，地塞米松棕櫚酸酯、地塞米松血藥濃度分別在5.32～1 596 ng·mL－1、2.138～320.7 ng·mL－1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。最低定量限（LLOQ）分別為5.32、2.138 ng·mL－1。

圖1 液-質(zhì)聯(lián)用圖譜A.空白血漿；B.地塞米松標(biāo)準(zhǔn)溶液；C.地塞米松棕櫚酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液；D.內(nèi)標(biāo)溶液；E.地塞米松血漿樣品；F.地塞米松棕櫚酸酯血漿樣品Fig1 LC-MS chromatogramsA.blank plasma；B.dexamethasone control；C.dexamethasone palmitate control；D.internal standard；E.dexamethasone plasma sample；F.dexamethasone palmitate plasma sample

2.4.4 精密度與回收率試驗(yàn)：取空白血漿1 mL，按“2.4.3”項(xiàng)下方法配制低、中、高3種濃度（地塞米松棕櫚酸酯為10.64、53.2和532 ng·mL－1；地塞米松為5.345、32.07和213.8 ng·mL－1）的質(zhì)量控制（QC）樣品，各5個(gè)樣本，連續(xù)測(cè)定3 d，測(cè)得地塞米松棕櫚酸酯3種濃度的日內(nèi)RSD＜14.56%，日間RSD＜7.55%，回收率分別為86.98%、85.37%、93.94%。測(cè)得地塞米松低、中、高3種濃度的日內(nèi)RSD＜7.96%，日間RSD＜7.41%，回收率分別為81.43%、95.96%、83.78%。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) ：分別配成濃度為10.64、532 ng·mL－1的地塞米松棕櫚酸酯血漿及濃度為5.345、213.8 ng·mL－1的地塞米松血漿各12份（n＝2），其中3份于配制好后立即按“2.4.1”項(xiàng)下方法操作；3份處理好的樣品在室溫放置6 h后按同法操作；3份于3次反復(fù)凍融后行穩(wěn)定性測(cè)定；3份密封后放入冰箱中－20℃保存30 d后行穩(wěn)定性測(cè)定。結(jié)果，地塞米松棕櫚酸酯含量RSD為4.18%、6.19%；地塞米松含量RSD分別為5.7%、8.2%，表明樣品在血漿中穩(wěn)定。

2.5 藥動(dòng)學(xué)

20例受試者靜脈滴注2種注射液后，地塞米松棕櫚酸酯及地塞米松的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)相近，平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。20例受試者靜脈滴注2種注射液后平均藥-時(shí)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2。

表1 20例受試者靜脈滴注2種注射液后平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n＝20）Tab1 Mean pharmacokinetic parameters of 2 kinds of injections in 20 healthy volunteers with intravenous administration（n＝20）

圖2 20例受試者靜脈滴注2種注射液后平均藥-時(shí)曲線(xiàn)（n＝20）A.地塞米松棕櫚酸酯；B.地塞米松Fig2 Mean concentration-time curves of 2 kinds of injections in 20 healthy volunteers with intravenous administration（n＝20）A.dexamethasone palmitate；B.dexamethasone

將受試制劑和參比制劑的AUC及cmax經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，以雙單側(cè)t檢驗(yàn)法進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)，結(jié)果表明上述2個(gè)參數(shù)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；對(duì)2種地塞米松棕櫚酸酯及地塞米松的tmax采用非參數(shù)Wilcoxon法統(tǒng)計(jì)，結(jié)果無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。表明受試制劑和參比制劑生物等效。

3 討論

本試驗(yàn)采用LC-MS法測(cè)定血漿樣品中地塞米松棕櫚酸酯及地塞米松的濃度。所測(cè)定的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)與報(bào)道相差不大，本方法快速、靈敏、專(zhuān)屬性強(qiáng)、檢測(cè)靈敏度高，可用于人體藥動(dòng)學(xué)及生物等效性研究。

[1]Yamamoto H，F(xiàn)ukuda M，Miyamoto Y，et al.A new trial liposteroid（dexamethasone palmitate）therapy for intractable epileptic seizures in infancy[J].Brain&Development，2007，299（7）：421.

[2]Yan YA，Hao LA.Simultaneous quantitation of dexamethasone palmitate and dexamethasone in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B，2008，862（1）：119.