幾種氨基酸對哲羅魚生長、消化酶活性及血液生化指標的影響

王常安，徐奇友，許 紅，尹家勝，孫大江

（中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070）

隨著動物蛋白供應(yīng)緊張，價格上漲，植物蛋白的研究與應(yīng)用越來越引起人們的關(guān)注。而當飼料中植物蛋白添加比例增大后，一個突出的問題是，飼料的適口性下降。促攝食物質(zhì)對改善飼料適口性，刺激嗅覺和味覺等感覺器官，提高飼料轉(zhuǎn)化效率，促進魚體生長等具有重要意義。日本、美國、前蘇聯(lián)早在60年代就開始采用多種方法對水產(chǎn)動物促攝食物質(zhì)進行了研究[1]，而國內(nèi)起步較晚[2]，僅在（Carassius auratus）[3]、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）[3]、黃鱔 (Monopterus albus)[4]等進行過研究。

氨基酸及其混合物是較好的魚類促攝食物質(zhì)，而有關(guān)氨基酸對哲羅魚的促生長研究鮮有報道。已有研究表明哲羅魚配合飼料中魚粉添加量應(yīng)不小于40%[5]，為降低魚粉的添加比例，本試驗研究了在低魚粉配合飼料中添加4種晶體氨基酸對哲羅魚的攝食、生長及生理生化指標的影響，以期為晶體氨基酸在哲羅魚飼料中的合理應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選擇體重為(9.29±0.34)g健康的哲羅魚幼魚750尾，隨機分至15個玻璃鋼水族箱（直徑90 cm，水深45 cm）中，每缸50尾。

1.2 試驗設(shè)計與試驗飼料

試驗共5個處理，每個處理3個重復(fù)。以魚粉含量30%的基礎(chǔ)飼料作為對照組，在此基礎(chǔ)上分別添加0.5%L-Glu、0.5%L-Ala、0.5%Gly和0.5%L-Pro晶體氨基酸，其中氨基酸添加量參照文獻[3-6]。飼料原料粉碎后過60目篩，制粒（1.5 mm），-20℃冰箱中保存。試驗基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)水平見表1[7]?；A(chǔ)飼料氨基酸組成及含量見表2（色氨酸未檢）。L-谷氨酸純度為99.6%，甘氨酸純度為99.1%，L-丙氨酸純度為95.8%，L-脯氨酸純度為99.0%。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營養(yǎng)組成（干重）Table 1 Ingredients and approximate composition in the basal diets(air-dry basis) (%)

續(xù)表

表2 飼料氨基酸分析結(jié)果（干重）Table 2 Analysis result of the amino acids in the basal diets(air-dry basis) (%)

1.3 飼養(yǎng)管理

以商用飼料馴化7 d后正式試驗，流水飼養(yǎng)（0.3×10-3）～（0.4×10-3）m3·h-1，養(yǎng)殖周期為 56 d。水溫9.8～14.2℃，進出水口溶氧8.0～9.0 mg·L-1，pH 7.5～7.8。每天投喂2次，分別在上午8：30和16：30進行，飽食投喂，各組盡量保持一致的投喂量。每14 d調(diào)整投喂量。試驗結(jié)束后，魚體饑餓24 h，稱重。每重復(fù)隨機采集8尾魚，其中4尾用于體成分分析，另4尾用于消化酶活性分析和血液生化指標。

1.4 樣品采集與分析

1.4.1 體成分

用105℃干燥恒重法測定水分含量；以凱氏定氮法測定粗蛋白；使用索氏乙醚抽提法測定粗脂肪；以馬福爐550℃灼燒樣品7 h測定粗灰分。

1.4.2 消化酶活性

冰盤上解剖，取出肝和消化道，剔除脂肪和內(nèi)含物，用冰浴生理鹽水洗凈，以濾紙吸干水分后稱重。加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，勻漿。4℃條件下，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液放為粗酶液，置于-80℃冰箱待測。蛋白酶測定采用福林-酚法[8]，脂肪酶用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法測定[9]，淀粉酶以淀粉-碘比色法測定[10]。

1.4.3 血液生化指標

尾部采血[11]。靜置30 min，在4℃條件，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，置于-80℃冰箱保存待測。血清生化指標采用生化分析儀（貝克曼ProCX4， 美 國）測 定 。 膽 固 醇（Cholesterol，CHOL）、甘油三酯（Glycerinate，TG）、血糖（Blood glucose，GLU）用酶法，補體C3和C4以免疫比色法，高密度脂蛋白（High density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）通過直接法，總蛋白（Total protein，TP）和球蛋白（Globulin，GLB）以化學法，白蛋白（Albumin，ALB）是計算值，堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）采用速率法。

1.5 統(tǒng)計分析

生物指標計算：增重率（%）=100×(Wt-W0)/W0；特定生長率（%）=100×(LnWt-LnW0)/t；攝食率（%）=100×F／W0；成活率（%）=100×Nf/Ni；肥滿度=100×Wt/Lt3；餌料系數(shù)=F/（Wt-W0）。

其中，W0為試驗開始時魚體質(zhì)量（g）；Wt為試驗結(jié)束時魚體質(zhì)量（g）；Nf為終末尾數(shù)；Ni為初始尾數(shù)；Lt試驗結(jié)束時魚體長（cm）；F為飼料攝入量（g）；t為飼養(yǎng)時間（d）。

試驗結(jié)果以平均值±標準差（X±S）表示，采用SAS 8.2進行單因素方差分析和Duncan′s多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸對哲羅魚生長性能影響

基礎(chǔ)飼料中分別添加0.5%的 L-Glu、L-Ala、Gly和L-Pro未顯著提高哲羅魚生長性能。各處理組哲羅魚增重率、特定生長率、肥滿度和成活率均未呈現(xiàn)顯著差異（P>0.05）。從各處理組的攝食率數(shù)據(jù)看，飼料中分別添加晶體氨基酸L-Glu、L-Ala、Gly、L-Pro后未顯著提高哲羅魚攝食量（P>0.05）。同時，飼料系數(shù)亦未呈現(xiàn)顯著變化（P>0.05）。在本試驗條件下，幾種晶體氨基酸單獨添加在哲羅魚基礎(chǔ)飼料中，其促攝食和生長效果并不明顯；幾種非必需氨基酸的添加亦未顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率。

表3 氨基酸對哲羅魚生長性能的影響Table 3 Effects of amino acids on growth performances in taimen Hucho taimen

2.2 對體成分影響

基礎(chǔ)飼料中分別添加0.5%L-Glu、0.5%LAla、0.5%Gly和0.5%L-Pro對哲羅魚魚體粗脂肪、粗灰分和水分均無顯著影響（P>0.05），特別對魚體粗蛋白亦均無顯著影響（P>0.05）?？梢钥闯觯诒驹囼灄l件下，幾種非必需氨基酸的添加對哲羅魚的身體組成影響不大。

結(jié)果見表4。

表4 氨基酸對哲羅魚體成分的影響Table 4 Effects of amino acids on proximate composition in taimen Hucho taimen （%）

2.3 對消化酶影響

如表5所示，飼料中分別添加0.5%L-Glu、0.5%L-Ala、0.5%Gly和0.5%L-Pro對哲羅魚肝蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均無顯著影響（P>0.05）；對胃蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均無顯著影響（P>0.05）；與對照組前腸＋幽門盲囊（哲羅魚的幽門盲囊個數(shù)較多，而且多分散在前腸部位，很難將兩者分開，故將兩者同時進行測定）蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均差異不顯著（P>0.05）；與對照組后腸蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均差異不顯著（P>0.05）?？梢?，飼料中分別添加0.5%L-Glu、0.5%L-Ala、0.5%Gly和0.5%L-Pro未顯著提高哲羅魚消化道及消化腺的消化酶活性，因而，未顯著改變機體消化能力。

表5 氨基酸對哲羅魚消化酶的影響Table 5 Effects of amino acids on digestive enzyme activities in taimen Hucho taimen (U·g-1)

2.4 對血液生化指標影響

飼料中分別添加0.5%L-Glu、0.5%L-Ala、0.5%Gly和0.5%L-Pro對哲羅魚血清生化指標影響（見表6）。由表中可以看出，各處理組間血清生化指標無顯著差異（P>0.05）。飼料中分別添加0.5%L-Glu、0.5%L-Ala、0.5%Gly和 0.5%L-Pro后并沒有顯著提高血清TP和ALB（P>0.05），未顯著影響轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST水平（P>0.05）；對血脂（TG、CHOL、HDL、LDL）及免疫指標（GLB、ALP、C3、C4）亦無顯著影響（P>0.05）。由此可以得出，飼料中幾種非必需氨基酸的添加，可能并未改變哲羅魚機體的代謝水平及免疫力。

表6 氨基酸對哲羅魚血液生化指標的影響Table 6 Effects of amino acids on serum indices in taimen Hucho taimen

3 討論與結(jié)論

水產(chǎn)動物促攝食物質(zhì)種類較多，而氨基酸是魚類促攝食物質(zhì)中主要的活性成分[12]，其主要包括L-谷氨酸、L-丙氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、L-組氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-蛋氨酸等[13]。如，L-谷氨酸對虹鱒（Oncorhynchus mykiss）具有一定誘食效果[14]；0.5 mmol·L-1L-丙氨酸對真鯛（Pagrosomus major）、條紋鱸（Moron saxasilis)和紅鰭東方鲀 (Takifugu rubripes)有較強引誘作用；0.5 mmol·L-1甘氨酸對條紋鱸和紅鰭東方鲀誘食效果較好[15]；L-脯氨酸對大西洋鮭(Salmo salar)和河鱒（Salmo trutta）誘食效果強烈[16]。但是不同種水產(chǎn)動物對不同的氨基酸反應(yīng)不同[13]。L-丙氨酸+L-精氨酸+甘氨酸在不同程度上抑制鯽的攝食，卻可引誘泥鰍積極攝食；L-丙氨酸可明顯引誘泥鰍攝食，而甘氨酸卻有顯著抑制作用[3]。本試驗結(jié)果表明，飼料中分別添加0.5%L-谷氨酸、0.5%L-丙氨酸、0.5%甘氨酸和0.5%L-脯氨酸后，哲羅魚的攝食率沒有顯著提高（P>0.05），可見，本試驗條件下，幾種晶體氨基酸對哲羅魚的促攝食效果并不明顯。一種原因可能是哲羅魚對晶體氨基酸的利用效果不明顯。徐奇友等研究表明，飼料中添加晶體氨基酸（L-蘇氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸）無明顯的促進生長作用[5]。其次，添加晶體氨基酸的濃度對哲羅魚并不適宜。對黃鱔進行的誘食試驗表明，隨著氨基酸濃度從0.5%增加到10.0%，L-精氨酸、L-丙氨酸對黃鱔攝食的影響從微弱抑制轉(zhuǎn)為促攝食作用，且促攝食作用隨著濃度的增加而增加[4]。此外，可能氨基酸單獨添加對哲羅魚的促攝食效果不明顯，而氨基酸與核苷酸等復(fù)合后對哲羅魚具有促生長效果。這因為在作為促攝食物質(zhì)——天然餌料提取物中，氨基酸、核苷酸和甜菜堿等共同存在[12]。日本鰻鱺（Anguilla japonicus）飼料中添加甘氨酸、L-脯氨酸、L-組氨酸、L-丙氨酸以及尿苷酸組成的復(fù)合誘食劑，可提高胃蛋白消化酶活性2倍，飼料效率2.16倍，蛋白質(zhì)效率2.15倍，同時降低血液中血糖和游離氨基酸含量[17]。

在畜禽飼料中添加晶體氨基酸可提高機體對蛋白質(zhì)的利用率和飼料轉(zhuǎn)化效率，從而起到促進畜禽生長效果。然而，水產(chǎn)動物利用晶體氨基酸的能力至今仍無確切結(jié)論，可能水產(chǎn)動物腸道能吸收蛋白質(zhì)分解出的氨基酸而不能直接吸收晶體氨基酸[18]。對虹鱒、鯉（Cyprinus carpio）、羅非魚（Tilapia mossambica）和凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）的研究結(jié)果表明，其利用晶體氨基酸的效率遠低于結(jié)合蛋白質(zhì)[18]。本研究表明，飼料中添加的0.5%L-谷氨酸、0.5%L-丙氨酸、0.5%甘氨酸、0.5%L-脯氨酸未被哲羅魚很好吸收。哲羅魚的肝、胃、腸道和幽門盲囊的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性無明顯變化，說明幾種晶體氨基酸的添加并沒有明顯改善魚體消化機能。氨基酸如果被吸收后，大部分會用作蛋白質(zhì)的合成，只有少部分多余的氨基酸會被脫去氨基，或轉(zhuǎn)化成脂質(zhì)和糖，或進入三羧酸循環(huán)被氧化釋放出能量[19]。從本試驗結(jié)果來看，添加幾種晶體氨基酸后機體的體成分并沒有發(fā)生顯著變化（P>0.05），血清轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白未顯著提高（P>0.05），說明幾種晶體氨基酸并沒有提高機體的蛋白合成能力，同時也證實晶體氨基酸可能并沒有被充分吸收。飼料中添加氨基酸還可影響水產(chǎn)動物免疫力。如：谷氨酸鹽在參與機體免疫作用中是一種重要的氨基酸，它在斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）巨噬細胞噬菌及淋巴細胞分解作用所必需，也是免疫作用中重要的能量來源；精氨酸能顯著影響斑點叉尾鮰體內(nèi)和體外一氧化氮的合成，從而調(diào)節(jié)機體免疫力[20]。本試驗飼料中添加0.5%L-谷氨酸、0.5%L-丙氨酸、0.5%甘氨酸和0.5%L-脯氨酸對哲羅魚血清球蛋白、補體C3、補體C4、堿性磷酸酶等免疫指標未發(fā)生改變，一方面可能由于哲羅魚的促攝食效果不明顯，同時，氨基酸未被吸收或吸收率很低，導致添加的氨基酸對機體生理生化指標影響較小。從另一方面來看，這些指標未能完全反映魚體的免疫力，因此，這幾種氨基酸是否已對哲羅魚魚體氨基酸免疫力產(chǎn)生影響，需要進一步證實。

此外，關(guān)于魚類促攝食物質(zhì)作用的研究，人們所采用的方法不同，這在很大程度上造成結(jié)果可比性較差[21]。目前，研究的方法主要有攝食行為法、電生理法和生長試驗法等，但各種方法各有利弊。薛敏等認為，首先應(yīng)通過攝食行為裝置和電生理方法，篩選出對魚類具有明顯有引誘作用的促攝食物質(zhì)，然后經(jīng)過長期生長試驗進行精確驗證[21]。哲羅魚于2000年養(yǎng)殖馴化成功，對沉底飼料攝食不積極，而對緩慢沉降的飼料攝食積極，采用迷宮法和觸球試驗不是理想研究手段；而能引起強烈神經(jīng)沖動的物質(zhì)又未必具有促攝食作用，因而，以攝食生長試驗研究哲羅魚促攝食物質(zhì)不失為一種較為有效的研究方法。

低魚粉基礎(chǔ)飼料中添加0.5%L-谷氨酸、0.5%L-丙氨酸、0.5%甘氨酸和0.5%L-脯氨酸對哲羅魚：①促攝食效果不明顯；②生長性能提高不顯著；③全魚的生化組成影響不明顯；④消化道及消化腺的消化酶活性影響不顯著；⑤血清生化指標影響不明顯。

[1] 李柯懋.水產(chǎn)動物誘食劑的研究進展[J].中國水產(chǎn),2005（8）:57-58.

[2] 尹海富,范兆廷,韓英,等.氨基酸水產(chǎn)餌料誘食劑[J].飼料博覽,2003,6:39-41.

[3] 伍一軍.氨基酸對鯽魚、泥鰍的誘食活性[J].水產(chǎn)學報,1993,17(4):337-339.

[4] 楊代勤,嚴安生,陳芳.幾種氨基酸及香味物質(zhì)對黃鱔誘食活性的初步研究[J].水生生物學報,2002,26(2):205-208.

[5] 徐奇友,王常安,許紅,等.大豆分離蛋白替代魚粉對哲羅魚稚魚生長、體成分和血液生化指標的影響[J].水生生物學報,2008,32(6):156-161.

[6] 唐麗花,王廣軍,余德光,等.幾種氨基酸對日本鰻鱺攝食、消化和生長的影響[J].大連水產(chǎn)學院院報,2009,24(6):574-577.

[7] 王常安,徐奇友,暢雅萍,等.幾種添加劑對哲羅鮭生長和血液生化指標的影響[J].大連水產(chǎn)學院院報,2009,24(6):1-5.

[8] 北京大學生物系生物化學教研室.生物化學試驗指導[M].北京:高等教育出版社,1979：73-74.

[9] 朱儉,曹凱鳴,周潤琦,等.生物化學試驗[M].上海:上?？茖W技術(shù)出版社,1981：190-193.

[10] 桂遠明.水產(chǎn)動物機能學試驗[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2004:92-93.

[11] 楊興棋.11魚類的采血技術(shù)[J].淡水漁業(yè),1979(增1):43-45.

[12] 荻野珍吉.魚類的營養(yǎng)與飼料[M].北京:海洋出版社,1987：17-22.

[13] 王安利,苗玉濤,王維娜,等.水產(chǎn)動物誘食劑的研究進展[J].中國水產(chǎn)科學,2002,9(3):265-268.

[14] Yamashita S,Yamada T,Hara T J.Gustatory responses to feeding and non feeding stimulant chemicals,with an emphasis on amino acids,in rainbow trout[J].Journal of Fish Biology,2006(68):783-800.

[15] 梁萌青.不同誘食劑對3種魚類誘食活性的研究[J].中國水產(chǎn)科學,2000,7(1):60-63.

[16] Hara T J,Kitada Y,Evans R E.Distribution patterns of palataltaste buds and their responses to amino acids in salmonids[J].Journal of Fish Biology,1994,45:453－465.

[17] 竹田正彥,陳維國.向鰻魚餌料中添加攝餌促進物質(zhì)的效果[J].國外水產(chǎn),1989(2):20－24.

[18] 遲淑艷,譚北平.水生動物復(fù)基酸營養(yǎng)研究進展[J].飼料工業(yè),2008,29(10):47－50.

[19] 霍湘,王安利,楊建梅.魚類對氨基酸的吸收代謝與需求[J].水利漁業(yè),2005,25(3):1－4.

[20] Buentello J A,Gatlin D M.Nitric oxide production in activated macrophages from channel catfish(Ictalurus punctatus):Influence of dietary arginine and culture media[J].Aquaculture,1999,179:513－521.

[21] 薛敏,解綬啟,崔奕波,等.魚類促攝食物質(zhì)研究進展[J].水生生物學報,2003,27(6):639－643.