豬ATIC基因SNPs位點(diǎn)分析和表達(dá)規(guī)律的研究

李金玲，李海濤，高麗峰，楊秀芹，劉 娣,2*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，哈爾濱 150086）

豬肉是我國(guó)最主要的食用肉類(lèi)。近幾年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，消費(fèi)者對(duì)豬肉產(chǎn)品的要求也逐漸從量向質(zhì)轉(zhuǎn)變，豬肉肉質(zhì)的風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)和安全成為了人們?cè)u(píng)定豬肉品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn)。目前，國(guó)內(nèi)外大量研究表明，氨基酸（谷氨酸和甘氨酸效果最明顯）、肌苷酸和肌內(nèi)脂肪與肉質(zhì)風(fēng)味密切相關(guān)。其中，肌苷酸是構(gòu)成肌肉鮮味和香味的主要成分之一[1]，其鮮味強(qiáng)度是等量谷氨酸鈉的30倍[2]。目前，國(guó)際上已把肌苷酸含量作為影響肉質(zhì)的重要指標(biāo)[3－4]。因而影響肌苷酸生成的各種基因都是肉質(zhì)性狀潛在的候選基因。

ATIC基因是編碼肌苷酸合成十步反應(yīng)中最后兩步反應(yīng)的酶基因。1995年Broad將綿羊的ATIC基因定位于2號(hào)染色體上[5]。人類(lèi)的ATIC基因cDNA全長(zhǎng)1 776 bp[6]。ATIC基因已在家雞中進(jìn)行了較為深入的研究。Ni等克隆了雞ATIC基因的cDNA序列，全長(zhǎng)2.3 kb[7]。本研究擬在分子水平上對(duì)民豬、北京黑豬、大白豬和長(zhǎng)白豬的ATIC基因進(jìn)行研究，探討不同品種豬之間風(fēng)味特性的差異與ATIC基因的關(guān)系，為尋找與豬肉風(fēng)味品質(zhì)性狀緊密連鎖的有效分子遺傳標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

長(zhǎng)白豬65頭、大白豬84頭均來(lái)自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)原種豬培育中心；北京黑豬50頭來(lái)自大慶采油四場(chǎng)豬場(chǎng)；東北民豬30頭來(lái)自黑龍江省蘭西種豬場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集、基因組DNA和總cDNA的制備

民豬、北京黑豬、大白豬、長(zhǎng)白豬4個(gè)豬種的基因組DNA樣品為實(shí)驗(yàn)室保存樣品。3頭民豬購(gòu)自黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，對(duì)其進(jìn)行斷頸宰殺，采集子宮、背肌、腸、肺、脾臟、肝臟、心臟、脂肪、腿肌共9種組織和器官樣品。按照Trizol Reagent總RNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取這9種組織的總RNA，利用Promega公司的RQ1 RNase－Free DNase處理提取的總RNA，排除基因組DNA的影響，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度和純度，利用1.4%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量，PrimeScript RT reagen Kit說(shuō)明書(shū)方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上發(fā)表的人ATIC基因的DNA序列（GenBank No:NC_000002）和豬 mRNA序列（GenBank No:NM_001130736）進(jìn)行比對(duì)，找到ATIC基因的外顯子6，并設(shè)計(jì)PCR－SSCP多態(tài)性分析引物P1F/P1R；根據(jù)ATIC基因的mRNA序列設(shè)計(jì)Real time PCR擴(kuò)增引物C1、C2，引物的相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 引物相關(guān)信息Table 1 Information of primers

1.2.3 多態(tài)性檢測(cè)

以民豬、北京黑豬、大白豬、長(zhǎng)白豬共214頭個(gè)體DNA為模板；進(jìn)行PCR－SSCP反應(yīng)，凝膠濃度為18%；電泳結(jié)束后，進(jìn)行銀染，顯色。

1.3 ATIC基因的表達(dá)分析

1.3.1 Real－time PCR反應(yīng)體系的建立

根據(jù)寶生物工程（大連）有限公司的SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒構(gòu)建20 μL反應(yīng)體系，采用兩步法Real－time PCR反應(yīng)程序，每個(gè)樣本重復(fù)3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及熒光曲線Ct值計(jì)算定量結(jié)果。

1.3.2 定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取已制備的豬9種組織cDNA樣品（50 ng·μL－1）各1 μL進(jìn)行混合，利用寶生物工程(大連)有限公司的EASY Dilution試劑按10倍濃度梯度稀釋為5、500、50、5、0.5 pg·μL－1。分別取 2 μL，對(duì)1 pg～100 ng的cDNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

BLAST方法進(jìn)行同源性比對(duì)，使用SPSS軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)、用PIC_Calc 0.6軟件進(jìn)行PIC值計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR-SSCP檢測(cè)結(jié)果

P2F/R引物的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PCR－SSCP檢測(cè)后，共發(fā)現(xiàn)三種基因型，兩種純合型分別命名為AA、BB。對(duì)兩種純合型個(gè)體進(jìn)行克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)，A等位基因在452、477、488 bp處的核苷酸分別為A、A、G；B等位基因在452、477、488 bp處的核苷酸分別為G、G、A（見(jiàn)圖1）。

圖1 PCR-SSCP電泳圖譜Fig.1 PCR-SSCP electrophoresis pattern

2.2 群體遺傳學(xué)分析

針對(duì)以上PCR－SSCP檢測(cè)結(jié)果，分析各基因型在北京黑豬、長(zhǎng)白豬和大白豬等豬種中的分布規(guī)律。各品種的檢測(cè)個(gè)體數(shù)、基因型頻率、基因頻率、多態(tài)信息含量（PIC）等統(tǒng)計(jì)參數(shù)值（見(jiàn)表2）。

χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)表明在所檢測(cè)的各多態(tài)位點(diǎn)，不同基因型在民豬、北京黑豬、長(zhǎng)白豬和大白豬等4個(gè)品種間的分布存在極顯著差異（P＜0.01）。χ2分割檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 ATIC基因在不同組織中的表達(dá)情況

2.3.1 Real－time PCR定量檢測(cè)民豬9種組織中ATIC基因的表達(dá)

經(jīng)過(guò)內(nèi)參β－actin對(duì)豬9種組織中ATIC基因表達(dá)量的校正，發(fā)現(xiàn)ATIC基因在肝臟、腿肌、肺等組織中表達(dá)量較高，按照表達(dá)量從高到低依次為：肝臟＞腿?。痉危拘呐K＞脾臟＞脊?。局荆灸c＞子宮，各組織表達(dá)譜及統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果（見(jiàn)圖2）。

表2 不同品種豬ATIC基因的基因型頻率和基因頻率Table 2 Allele ferquencies and genotype frequencies of ATIC among different swine breeds

表3 ATIC各基因SNP位點(diǎn)在不同群體中的基因型分布的χ2檢驗(yàn)Table 3 Chi-square testing of ATIC gene for genotype distribution of SNPs between breeds

圖2 民豬9種組織中ATIC基因的表達(dá)情況Fig.2 Expression of ATIC in nine kinds of tissues of pig

3 討論

肌苷酸合成過(guò)程中涉及10種酶，其中ATIC是具有氨基咪唑氨甲酰核苷酸轉(zhuǎn)甲酰基酶和次黃嘌呤核苷酸環(huán)水解酶催化活力的雙功能酶，并且是唯一一個(gè)編碼兩種酶催化活力的雙功能酶[9]。在雞中對(duì)ATIC基因與肉質(zhì)風(fēng)味關(guān)系研究有很多，研究表明，該基因多態(tài)性與肌苷酸含量有關(guān)[10]。2005年，劉長(zhǎng)青對(duì)部分雞種ATIC基因cDNA全序列進(jìn)行分子掃描，認(rèn)為該基因是影響雞肉風(fēng)味性狀的主效基因或是控制此性狀主效基因的連鎖標(biāo)記基因[8]；2008年束婧婷對(duì)5個(gè)雞種的ATIC基因進(jìn)行分子掃描，認(rèn)為該基因可能是控制雞肉風(fēng)味性狀的主效基因或與主效基因連鎖[10]。

本文通過(guò)對(duì)豬ATIC基因外顯子6進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)掃描，并應(yīng)用PCR－SSCP技術(shù)進(jìn)行遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)不同基因型在民豬、北京黑豬、長(zhǎng)白豬和大白豬等4個(gè)豬種間的分布存在著極顯著差異（P＜0.01）。并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了ATIC基因在各組織中的表達(dá)差異，研究發(fā)現(xiàn)肝臟、腿肌、肺等組織中高表達(dá)，其中以肝臟中的表達(dá)量最高。從這一結(jié)果可以看出，肝臟在肌苷酸合成過(guò)程中具有重要的生理作用。

在本試驗(yàn)所檢測(cè)4個(gè)豬種中長(zhǎng)白豬和大白豬均以A等位基因?yàn)橹?，其中大白豬沒(méi)有檢測(cè)到B等位基因，而我國(guó)地方豬種民豬和北京黑豬則以B等位基因?yàn)橹?。多態(tài)信息含量（PIC）的分析結(jié)果表明長(zhǎng)白豬和大白豬均為低度多態(tài)（PIC＜0.25），而民豬和北京黑豬為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5），表明民豬和北京黑豬的遺傳基礎(chǔ)比較廣泛，遺傳多樣性好于長(zhǎng)白豬和大白豬。

在本研究所檢測(cè)到的三個(gè)突變位點(diǎn)中，兩處為錯(cuò)義突變，一處為非錯(cuò)義突變，其中452 bp處的錯(cuò)義突變?cè)斐闪税被針O性的改變，由親水性的半胱氨酸代替了疏水性的酪氨酸。477 bp處為非錯(cuò)義突變，488 bp處的錯(cuò)義突變?cè)斐山z氨酸被天冬酰胺替代。

由于缺乏相應(yīng)個(gè)體肌苷酸含量的數(shù)據(jù)，本研究所得多態(tài)位點(diǎn)是否是不同豬種肉質(zhì)風(fēng)味差異的影響因素之一尚有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

[1] 陳國(guó)宏,李慧芳,吳信生,等.泰和烏骨雞肌肉肌苷酸含量變化規(guī)律及其遺傳力估測(cè)[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2002,23(2):29－32.

[2] 陳繼蘭.雞肉肌苷酸和肌內(nèi)脂肪含量遺傳規(guī)律及相關(guān)候選基因的研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.

[3] 岳永生,唐輝.優(yōu)質(zhì)肉雞定量標(biāo)準(zhǔn)的探討[C].第九次全國(guó)動(dòng)物遺傳育種學(xué)討論會(huì)論文集,北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社,1997:348－351.

[4] Fuijmura S.Identification of tuste－active component components in the meat of the Japanese native chicken,Hinaidori and broilers and the effent of feeding treatments on taste－active components[J].Animal Food Science,1998,50(2):99－158.

[5] Broad T E,Lewis P E,Burkin D J,et al.Thirteen loci physicallyassigned tosheep chromosome 2 by cell hybrid analysis and in situ hybridization[J].Mammalian Genome,1995,6(12):862－866.

[6] Elizabeth A,Rayl Barbara A.The human purH gene product,5－aminoimidazole－4－carboxamide ribonucleotideformyl－transferase/IMPcyclohydrolase.Cloning,sequencing,expression,purification,kinetic analysis,and domain mapping[J].Journal of Biological Chemistry,1996,271(4):2225－2233.

[7] Ni L,Guan K,Zalkin H,et al.De novo purine nucleotide biosynthesis:cloning,sequencing and expression of a chicken PurH cDNA encoding 5－aminoimidazole－4－carboxamide－ribonucleotide transformylase－IMP cyclohydrolase[J].Gene,1991,106(2):197－205.

[8] 劉長(zhǎng)青.山東地方雞種風(fēng)味特性的候選基因ADSL和ATIC的研究[D].曲阜:曲阜師范大學(xué),2005:56－66.

[9] 張海艷,于太永,關(guān)偉軍.肌苷酸形成機(jī)理及其含量影響因素淺析[J].山西:山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2004,6(3):17－21.

[10] 束婧婷.雞肌苷酸候選基因遺傳效應(yīng)及表達(dá)規(guī)律研究[D].揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2008:78－79.