腎舒康合劑對馬杉氏腎炎白兔腎組織形態(tài)的影響Δ

閆翠環(huán)，方敬，陳志強，王艷素，陳金金，劉云肖，姜秀娟（.河北醫(yī)科大學，石家莊市05009；2.河北醫(yī)科大學中醫(yī)院，石家莊市 0500；.河北省人民醫(yī)院，石家莊市 05005）

馬杉氏腎炎（Masugiglomerulonephritis，MGN）是一種典型的抗腎小球基底膜性腎小球腎炎，其主要臨床表現(xiàn)為腎病綜合征（NS），隨著疾病的發(fā)展甚至會引起腎功能的嚴重損傷[1]。前期研究證實[2]，腎舒康合劑能使陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）致膜性腎小球腎炎動物的尿蛋白明顯減少，降低血清肌酐和血尿素氮的含量，改善腎組織的病理狀態(tài)。筆者通過給白兔注射羊抗兔腎血清復制MGN模型，同時用腎舒康合劑進行干預性治療，以探討腎舒康合劑對MGN的治療作用及其可能的機制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HM IAS-2000型醫(yī)學彩色圖像分析系統(tǒng)（武漢千屏影像技術有限責任公司）；H7500型透射電鏡（日本Hitachi公司）；LSM 510META型熒光顯微鏡、HM 340E型石蠟切片機（德國Zeiss公司）；UCT型超薄切片機（德國Leica公司）。

1.2 試藥

腎舒康合劑（由黃芪、黃精、白花蛇舌草、地龍、川芎、積雪草、柴胡、丹參、生地黃、石葦組成，藥材均購自河北省安國市一方中藥材有限公司，由河北醫(yī)科大學中醫(yī)院中藥房孟熙中藥師鑒定為真品）由河北醫(yī)科大學中醫(yī)院提供（批號：20100209）；雷公藤多苷（湖南協(xié)力藥業(yè)有限公司，批號：20050702）；弗氏完全佐劑（美國Sigma公司，批號：Lot102K8930）。

1.3 動物

清潔級成年綿羊1只，♀，體重25 kg，由解放軍第二軍醫(yī)大學動物中心提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2007-0003）；健康新西蘭種大耳白兔40只，♀♂兼半，體重1.75～2.25 kg，由武漢市新州區(qū)全耀動物養(yǎng)殖場提供（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（鄂）2004-0006）。

2 方法

2.1 復制模型與分組

按文獻方法[3]制備羊抗兔腎血清，將所有白兔隨機分為正常、模型、腎舒康合劑、雷公藤多苷組。除正常組外，其余各組白兔均經(jīng)耳緣iv羊抗兔腎血清，每次2m L，間隔0.5 h注射1次，共6次。檢測尿蛋白呈陽性反應，表明MGN模型復制成功[4]。

2.2 給藥

文獻報道[2]，腎舒康合劑對MGN模型白兔腎炎的治療中，中劑量組與雷公藤多苷組療效差異無顯著性，3倍遞增的高劑量組作用優(yōu)于雷公藤多苷組，故筆者選擇相當于中劑量組的生藥劑量重點觀測。各組用藥量分別為：腎舒康組8.16 g·kg-1，雷公藤多苷組5mg·kg-1，模型和正常組給予等容量生理鹽水，于復制模型成功后第1天開始ig給藥，每天1次，連續(xù)4周。

2.3 標本采集與檢測

2.3.1 光鏡觀察 于用藥4周后殺檢白兔，取部分腎組織，4%多聚甲醛溶液固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，以3μm的石蠟切片，行HE、PASM染色，光學顯微鏡下觀察并拍片。置普通光學顯微鏡下觀察腎小球及腎小管間質(zhì)病變情況。每份標本于低倍鏡下觀察20個不同的腎小管間質(zhì)視野，按腎小球纖維素沉積數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)進行半定量評分，評估腎小管間質(zhì)損傷程度。

2.3.2 電鏡觀察 取右腎上極皮質(zhì)1mm3，經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸磷酸鈉緩沖液雙固定，丙酮梯度脫水，815環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察并拍片。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 腎組織病理形態(tài)半定量圖像分析結果

腎舒康合劑組和雷公藤多苷組與模型組比較，纖維素沉積數(shù)顯著下降（P＜0.01），腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)顯著下降（P＜0.05）。腎小球纖維素沉積數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較結果見表1（空白組略去）。

表1 腎小球纖維素沉積數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較結果（±s，n＝10）Tab 1 Com parison of the cellulose deposition number and tubular injury inde（x±s，n＝10）

表1 腎小球纖維素沉積數(shù)、腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)比較結果（±s，n＝10）Tab 1 Com parison of the cellulose deposition number and tubular injury inde（x±s，n＝10）

與模型組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.modelgroup：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別模型組腎舒康合劑組雷公藤多苷組腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)3.16±0.75 2.31±0.67＊2.28.±0.36＊n 81 0 10纖維素沉積數(shù)/%80.84±11.36 61.46±20.31＊＊61.24±19.73＊＊

3.2 光鏡觀察結果

3.2.1 HE染色 與正常組比較，模型組基底膜彌散性增厚，系膜基質(zhì)增多，膠原纖維增生，可見局灶節(jié)段性腎小球硬化，腎小球囊壁層細胞增生，有新月體形成；腎小管上皮細胞顆粒樣變性、腫脹，管腔狹窄，部分小管腔內(nèi)可見蛋白、管型；間質(zhì)有炎性細胞浸潤。與模型組比較，腎舒康合劑組膠原纖維增生不明顯，未出現(xiàn)腎小球硬化，未見新月體形成，腎小管間質(zhì)病變明顯減輕；雷公藤多苷組的病理改變與腎舒康組相似，但腎小管間質(zhì)病變程度較腎舒康合劑組的略輕。病理切片（HE染色）見圖1。

圖1 病理切片（HE，400×）A.正常組；B.模型組；C.腎舒康合劑組；D.雷公藤多苷組Fig 1 Pathologicalslice（HE，400×）A.normal group；B.model group；C.Shenshukang mixture group；D.triptergium glycosidesgroup

3.2.2 PASM染色 正常組基底膜正常，呈黑色，系膜基質(zhì)呈黑細絲狀，腎小管間質(zhì)無異常。模型組可見基底膜重度彌散性增厚，可見局灶節(jié)段性腎小球硬化，毛細血管內(nèi)皮細胞變性，管腔擴張充血，間質(zhì)有炎性細胞浸潤，可見散在的纖維增生。與模型組比較，腎舒康合劑組未出現(xiàn)腎小球硬化，腎小球囊內(nèi)壁光滑，未見新月體形成，毛細血管內(nèi)皮細胞輕度腫脹；雷公藤多苷組的病理改變與腎舒康合劑組相似。病理切片（PASM染色）見圖2。

圖2 病理切片（PASM，400×）A.正常組；B.模型組；C.腎舒康合劑組；D.雷公藤多苷組Fig 2 Pathologicalslice（PASM，400×）A.normal group；B.model group；C.Shenshukang m ixture group；D.triptergium glycosidesgroup

3.3 電鏡觀察結果

正常組腎小球上皮細胞、內(nèi)皮細胞、基底膜結構均正常，上皮細胞足突結構清晰，呈杵樣并列排列于基底膜外側；內(nèi)皮細胞窗孔排列整齊；基底膜結構均勻完整。模型組腎小球基底膜呈節(jié)段性不規(guī)則增厚；上皮細胞足突腫脹，排列紊亂，出現(xiàn)節(jié)段性輕、中度融合，毛細血管內(nèi)皮細胞嚴重腫脹。腎舒康合劑組與雷公藤多苷組腎小球基底膜增厚不明顯，或僅呈輕度增厚，腎小球上皮細胞足突有部分融合；內(nèi)皮細胞窗孔排列基本整齊；毛細血管內(nèi)皮細胞無明顯腫脹。病理切片（透射電鏡）見圖3。

圖3 病理切片（透射電鏡，20 000×）A.正常組；B.模型組；C.腎舒康合劑組；D.雷公藤多苷組Fig 3 Pathologicalslice（TEM，20 000×）A.normal group；B.model group；C.Shenshukang m ixture group；D.triptergium glycosidesgroup

4 討論

MGN模型是于1900年由LindemanW首次介紹[5]，其后由Masugi加以發(fā)展和特征化，故名Masugi腎炎。它是異種抗體直接與腎小球基底膜上的抗原相結合形成的一種腎炎模型，是一種典型的抗腎小球基底膜的腎小球腎炎。慢性腎臟疾病最終導致終末期腎衰的發(fā)生，其特征是腎功能的逐漸丟失、細胞外基質(zhì)（ECM）的持續(xù)堆積，從而導致間質(zhì)纖維化。多種腎臟疾病腎功能的惡化很大程度上取決于間質(zhì)損害的嚴重性[6]。

腎舒康合劑由黃芪、黃精、生地黃、丹參、川芎、石葦、白花蛇舌草、積雪草、柴胡、地龍10味中藥組成，共奏健脾補腎、活血化瘀、清熱利濕之功效。黃芪含有黃芪多糖、黃芪皂苷類、黃酮和黃酮類似物等成分，有清除自由基、促進蛋白質(zhì)合成、誘生干擾素等作用；黃芪還富含微量元素硒，對腎小球基底膜的電荷屏障和機械屏障均有保護作用，從而減輕通透性蛋白尿，對腎性蛋白尿有減輕和消除作用，改善腎小管損傷和間質(zhì)纖維化病變，保護腎組織[7，8]；與黃精、生地黃配伍還能提高機體的非特異性免疫力，發(fā)揮對腎組織的保護作用。丹參是治療腎纖維化的常用中藥之一，其分離出的有效成分丹參酮ⅡA磺酸鈉可通過對腎組織結締組織生長因子（CTGF）的抑制而發(fā)揮防治腎間質(zhì)纖維化的作用[9]。川芎嗪能改善動物的高凝狀態(tài)，減輕腎小球ECM過度凝集狀態(tài)和腎間質(zhì)單核巨噬細胞浸潤所引起的炎癥過程，減少尿蛋白，延緩腎功能損害[10]。丹參、川芎與地龍合用可起到改善高凝狀態(tài)，清除自由基，抑制和排除免疫復合物的作用。白花蛇舌草有清熱除濕、活血止痛等功效，其含有的總黃酮具有增強機體特異性免疫功能和非特異性免疫功能的作用，亦可以刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)增生，增強吞噬細胞活力而達到抗菌消炎作用[11]。積雪草可以通過直接抑制生長轉化因子（TGF-β1）的表達并間接維持重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的表達來實現(xiàn)抗腎間質(zhì)纖維化的作用[12]。

本研究結果表明，腎舒康合劑能明顯抑制ECM和毛細血管內(nèi)皮細胞的增生，減輕腎小管管腔狹窄的變化，通過保護腎小球濾過膜，修復損傷的腎小球上皮細胞發(fā)揮減輕病理損害、防止腎臟受到進一步損傷的作用。

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