毛細(xì)管電泳法同時(shí)測(cè)定三黃片中7種有效成分的含量Δ

劉 丹，毋福海，曾承輝（廣東藥學(xué)院，廣州市 510224）

三黃片是由大黃、黃芩浸膏、鹽酸小檗堿制成的中藥成方制劑，具有清熱解毒、瀉火通便等功效，臨床用于三焦熱盛所致的目赤腫痛、口鼻生瘡、咽喉腫痛、牙齦腫痛、心煩口渴、尿黃、便秘等的治療，亦用于急性胃腸炎、痢疾的治療。其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素和大黃酚的含量[1]，有采用HPLC法測(cè)定三黃片中大黃素、大黃酚、黃芩苷和鹽酸小檗堿含量的報(bào)道[2～12]，亦有膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法測(cè)定三黃片中3種蒽醌類(lèi)活性成分含量的報(bào)道[13]，但采用毛細(xì)管電泳法同時(shí)測(cè)定三黃片中多種有效成分的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，筆者建立了同時(shí)測(cè)定三黃片中漢黃芩苷（Wogonoside）、漢黃芩素（Wogonin）、大黃素（Emodin）、蘆薈大黃素（Aloe-emodin）、大黃酸（Rhein）、大黃酚（Chrysophanol）、大黃素甲醚（Physcion）含量的毛細(xì)管電泳法，為更好地控制三黃片的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

CL1030型高效毛細(xì)管電泳儀（北京彩陸科學(xué)儀器有限公司）；K-2501紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器（德國(guó)KNAUER公司）；HW-2000色譜工作站2.17版（南京千譜軟件有限公司）；未涂層彈性融硅石英毛細(xì)管柱（河北銳年永灃色譜器件有限公司，55 cm×75μm ID）。

漢黃芪苷對(duì)照品（安徽蕪湖甙爾塔醫(yī)藥科技有限公司，純度：98.0%）；漢黃芩素對(duì)照品（批號(hào)：111514-200403）、大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-200110）、蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110795-200504）、大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：0757-200206）、大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-200513）、大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-200610）、對(duì)乙酰氨基酚（paracetamol）對(duì)照品（批號(hào)：100018-200408）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；三黃片（河南創(chuàng)新藥業(yè)有限公司，批號(hào)：0705321、0705101、0803221，規(guī)格：每片0.26 g）；磺丁基-β-環(huán)糊精（磺丁基-β-CD，山東新大精細(xì)化工有限公司，含量：99%，批號(hào)：080101）；水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 內(nèi)標(biāo)貯備液的制備 精密稱(chēng)取適量對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品，加甲醇溶解稀釋?zhuān)瞥?50μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)貯備液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃酚對(duì)照品12.9、12.5、22.5 mg，各置于50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度分別為252、250、450 μg·mL－1的漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃酚對(duì)照品貯備液。精密稱(chēng)取大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚對(duì)照品20、15、25、12.5 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度分別為200、150、250、125 μg·mL－1的大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素甲醚對(duì)照品貯備液。精密移取漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品貯備液10、5、10、10、10、20、10 mL，置于同一100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別為25.2、12.5、20、15、25、90、12.5 μg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取三黃片20片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，求得平均片重。取約0.15 g，精密稱(chēng)定，置于100 mL具塞錐形瓶中，加30 mL乙醇，超聲處理1 h，濾過(guò)，水浴揮干乙醇，冷卻，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍哭D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加入1.0 mL內(nèi)標(biāo)貯備液，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜過(guò)濾，作為供試品溶液。

2.1.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取處方組成中除大黃和黃芩浸膏外的其他成分，按“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成不含黃芩和大黃的陰性對(duì)照溶液。

2.1.5 運(yùn)行緩沖液的制備 精密稱(chēng)取1.802 4 g硼砂、2.383 6 g十二烷基磺酸鈉（SDS）、1.349 2 g磺丁基-β-CD，置于250 mL量瓶中，加甲醇20 mL，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜過(guò)濾，作為運(yùn)行緩沖液。

2.2 電泳條件

毛細(xì)管柱：未涂層彈性融硅石英柱（55 cm×75μm ID，有效長(zhǎng)度 47 cm）；運(yùn)行緩沖液：25 mmol·L－1硼砂溶液+25 mmol·L－1SDS+4 mmol·L－1磺丁基-β-CD+8%甲醇（pH 9.42）；分離電壓：14 kV；重力進(jìn)樣時(shí)間：5 s（高度：15 cm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；溫度：25℃；濕度＜70%。毛細(xì)管柱在使用前依次用0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液、水、運(yùn)行緩沖液各沖洗約5 min。在此條件下，對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照的色譜見(jiàn)圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

分別吸取一定量的混合對(duì)照品溶液，加甲醇稀釋成漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚濃度分別為2.02、5.04、10.08、15.12、20.16 μg·mL－1，1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg·mL－1，1.6、4.0、8.0、12.0、16.0 μg·mL－1，1.2、3.0、6.0、9.0、12.0 μg·mL－1，2.0、5.0、10.0、15.0、20.0μg·mL－1，7.2、18.0、36.0、54.0、72.0 μg·mL－1和 1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg·mL－1，內(nèi)標(biāo)濃度為25 μg·mL－1的溶液。分別進(jìn)樣，以對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（R）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，分別得回歸方程R1＝0.035 8c+0.038 6（r＝0.999 6）、R2＝0.072 6C+0.025 3（r＝0.999 3）、R3＝0.060 8C+0.093 8（r＝0.999 6）、R4＝0.123 7C+0.048 6（r＝0.999）、R5＝0.063 4C+0.088 3（r＝0.999 5）、R6＝0.149 2C+0.423 6（r＝0.998 6）、R7＝0.146 4C+0.034 0（r＝0.998 1）。結(jié)果表明，漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚檢測(cè)濃度分別在2.02～20.16、1.0～10.0、1.6～16.0、1.2～12.0、2.0～20.0、7.2～72.0、1.0～10.0 μg·mL－1范圍內(nèi)與各自峰面積積分值的線性關(guān)系良好。

圖1 毛細(xì)管電泳色譜圖Fig 1 Capillary electrophoresis chromatograms

2.4 精密度試驗(yàn)

取濃度分別為10.08、5.0、8.0、6.0、10.0、36.0、5.0 μg·mL－1的漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品溶液適量，分別進(jìn)樣，連續(xù)測(cè)定5次，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果，漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為2.00%、0.98%、1.95%、0.98%、1.86%、1.60%、1.93%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液（批號(hào)：0705321）適量，于0、2、4、6、8、10、12 h分別進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算RSD。結(jié)果，漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為2.52%、2.02%、1.30%、3.13%、2.15%、2.14%、1.00%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)（批號(hào)：0705321）樣品適量，共6份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法提取、測(cè)定。結(jié)果，漢黃芩苷的平均含量為0.58 mg·g－1，RSD＝2.65%（n＝6）；漢黃芩素的平均含量為0.25 mg·g－1，RSD＝2.04%（n＝6）；大黃素的平均含量為 0.56 mg·g－1，RSD＝1.73%（n＝6）；蘆薈大黃素的平均含量為0.40 mg·g－1，RSD＝1.49%（n＝6）；大黃酸的平均含量為 0.64 mg·g－1，RSD＝1.63%（n＝6）；大黃酚的平均含量為 2.39 mg·g－1，RSD＝2.59%（n＝6）；大黃素甲醚的平均含量為0.35 mg·g－1，RSD＝1.00%（n＝6）?？梢?jiàn)，本法精密度良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一批號(hào)（批號(hào)：0705321）樣品適量，共6份，加入一定量的漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1、表2、表3、表4、表5、表6、表7。由上表可見(jiàn)，漢黃芩苷平均回收率為100.7%，RSD＝1.17%；漢黃芩素平均回收率為98.1%，RSD＝1.51%；大黃素平均回收率為99.9%，RSD＝2.78%；蘆薈大黃素平均回收率為101.3%，RSD＝1.48%；大黃酸平均回收率為99.8%，RSD＝2.76%；大黃酚平均回收率為102.0%，RSD＝2.61%；大黃素甲醚平均回收率為101.8%，RSD＝2.01%。

表1 漢黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of Wogonoside recovery experiment（n＝6）

表2 漢黃芩素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 2Results of Wogonin acid recovery experimen（tn＝6）

表3 大黃素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 3 Results of emodin acid recovery experiment（n＝6）

2.8 樣品含量測(cè)定

取3批三黃片樣品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程，計(jì)算樣品中7組分的含量，結(jié)果見(jiàn)表8。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

大黃中重要的活性成分是蒽醌類(lèi)化合物及其衍生物，黃芩含有黃酮成分，7種成分化學(xué)結(jié)構(gòu)不盡相同，其紫外吸收亦不相同，為了保證各成分都具有適宜的靈敏度，筆者測(cè)定了7種成分在甲醇中的紫外吸收光譜。結(jié)果，漢黃芩苷在270 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，漢黃芩素在276.5 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，而大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚在254 nm波長(zhǎng)處均有最大吸收。綜合考慮，選擇254 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

表4 蘆薈大黃素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 4 Results of aloe-emodin acid recovery experiment（n＝6）

表5 大黃酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 5Results of rehein acid recovery experiment（n＝6）

表6 大黃酚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 6 Results of chrysophanol acid recovery experiment（n＝6）

表7 大黃素甲醚加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 7Results of physcion acid recovery experiment（n＝6）

表8 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，μg·mL－1）Tab 8 Results of content determination of samples（n＝3，μg·mL－1）

3.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇

為克服毛細(xì)管電泳重現(xiàn)性差的缺點(diǎn)，筆者采用內(nèi)標(biāo)法定量。因所測(cè)物質(zhì)為黃酮、蒽醌類(lèi)成分，均為陰離子，因此須找到一種陰離子物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，嘗試過(guò)的物質(zhì)有對(duì)氨基苯甲酸、對(duì)氨基苯磺酸、布諾芬、布比卡因、橙皮苷，但是都因?yàn)榕c被測(cè)物質(zhì)出峰時(shí)間太接近，達(dá)不到很好的分離效果。綜合考慮，最后確定對(duì)乙酰氨基酚，因其與被測(cè)7種物質(zhì)性質(zhì)相近，且對(duì)其他物質(zhì)出峰無(wú)干擾，可以作為內(nèi)標(biāo)。

3.3 電泳條件的選擇

3.3.1 硼砂濃度的影響 鑒于漢黃芩苷、漢黃芩素、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚均為弱酸性的多羥基化合物，應(yīng)選擇堿性緩沖體系。硼砂能與多羥基化合物形成配位鍵，增加負(fù)電性，是分離這7種物質(zhì)的良好體系。當(dāng)SDS濃度為25 mmol·L－1、磺丁基-β-CD濃度為4 mmol·L－1、甲醇比例為8%時(shí)，分別考察硼砂濃度為20、25、30 mmol·L－1時(shí)對(duì)各成分分離的影響。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)硼砂濃度為20 mmol·L－1時(shí)，大黃素甲醚無(wú)有效淌度，而且此時(shí)基線不穩(wěn)，其余分析物峰形較差。而當(dāng)硼砂濃度為30 mmol·L－1時(shí)，時(shí)間窗口增大，分離度有所改善，但同時(shí)電流增大，保留時(shí)間也增加了。只有當(dāng)硼砂濃度為25 mmol·L－1時(shí)，各分析物的峰形都較好，且能達(dá)到基線分離，并都能在30 min內(nèi)完成分離測(cè)定。綜合分離情況，分析時(shí)間、電流等因素，確定硼砂的濃度為25 mmol·L－1。

3.3.2 SDS濃度的影響 當(dāng)硼砂濃度為25 mmol·L－1，磺丁基-β-CD濃度為4 mmol·L－1，甲醇比例為8%時(shí)，討論SDS濃度在5～30 mmol·L－1范圍內(nèi)變化時(shí)對(duì)分析物遷移時(shí)間的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)SDS濃度＜25 mmol·L－1時(shí)，漢黃芩苷、漢黃芩素可以基線分離，大黃素和蘆薈大黃素不能基線分離，其余分析物的峰形差。隨著SDS濃度的增大，各分析物的峰形越來(lái)越好，在25 mmol·L－1時(shí)達(dá)到最佳。而超過(guò)此濃度，如在30 mmol·L－1時(shí)，各分析物的峰形開(kāi)始變差，基線不穩(wěn)，電流增大，并且保留時(shí)間也相應(yīng)延長(zhǎng)。因此，選擇SDS濃度為25 mmol·L－1。

3.3.3 有機(jī)添加劑的影響 試驗(yàn)中比較了不含有機(jī)溶劑的緩沖體系，發(fā)現(xiàn)大黃素和蘆薈大黃素?zé)o法分離，其他分析物的峰形差，基線不穩(wěn)，出現(xiàn)一些雜峰，電流太高。在緩沖體系中加入少量的有機(jī)溶劑，可以改善分離度或分離選擇性，并使許多水難溶的樣品得以用毛細(xì)管電泳分離，因此筆者考察了乙腈、乙醇、甲醇等添加劑對(duì)分離的影響。發(fā)現(xiàn)加入乙腈后，基線變得平滑，但因?yàn)槠浣殡姵?shù)小，電流減小，保留時(shí)間長(zhǎng)，且柱效低，峰展寬嚴(yán)重，對(duì)分離情況的改善無(wú)幫助；將乙腈換成乙醇后，基線漂移，峰形變差；改用甲醇，因其介電常數(shù)小，電流減小，大黃素和蘆薈大黃素可以達(dá)到基線分離，其他各分析物的峰形好，時(shí)間窗口增大。但甲醇比例在0～5%時(shí)分離情況不佳，出于對(duì)分離和遷移時(shí)間的綜合考慮，選擇8%的甲醇。

3.3.4 磺丁基-β-CD的影響 當(dāng)緩沖體系中未加磺丁基-β-CD時(shí)，只能將大黃素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚5種成分分離，漢黃芩苷與漢黃芩素之間不能基線分離，且實(shí)際中藥樣品中的成分非常復(fù)雜，漢黃芩素因有其他未知成分的干擾而分離不佳。由于CD不僅是手性選擇劑，而且被廣泛用作膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳的添加劑，CD的2個(gè)重要特性參數(shù)是環(huán)狀分子空腔直徑和疏水性。CD在分離中的作用之一是立體空間的選擇性。較小的溶質(zhì)分子可以進(jìn)入CD的疏水性空腔內(nèi)部，較大的分子則受到限制，從而產(chǎn)生對(duì)溶質(zhì)分子大小的選擇性[14]。加入磺丁基-β-CD后，峰形變窄，分離效果好。筆者考察了磺丁基-β-CD濃度對(duì)分離情況的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其濃度為4 mmol·L－1時(shí)，各分析物的分離度好，如濃度＞4 mmol·L－1則會(huì)使電流過(guò)大，繼而基線漂移，使分離情況變差。綜合考慮對(duì)分離和遷移時(shí)間的影響，本試驗(yàn)最終選擇磺丁基-β-CD的濃度為4 mmol·L－1。

3.3.5 分離電壓的影響 在毛細(xì)管電泳中，提高分離電壓可以縮短分離時(shí)間，但是在高電壓下會(huì)由于焦耳熱的影響，使溶質(zhì)產(chǎn)生擴(kuò)散現(xiàn)象，從而降低毛細(xì)管電泳的分離效率。本試驗(yàn)考察了14.0～20.0 kV電壓對(duì)分離的影響，綜合考慮各影響因素，選擇最佳分離電壓為14 kV。

3.4 提取方法的選擇

曾采用甲醇超聲提取法[2]、乙醇超聲提取法[12]，最后發(fā)現(xiàn)用乙醇超聲處理1 h，濾過(guò)，水浴揮干乙醇，冷卻，殘?jiān)蛹状既芙獾奶崛》椒ㄐЧ詈?，能將待測(cè)物完全提取出來(lái)，而且操作簡(jiǎn)便、易行，最后選用此法。

綜上所述，本方法專(zhuān)屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可用于三黃片的質(zhì)量控制。

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