LC-MS/MS法測定人血漿中替米沙坦的濃度及其人體生物等效性研究

王國才，張丹，楊漫，鄭天雷，王濤，王振龍，韓靜，劉會臣（航天中心醫(yī)院臨床藥理室，北京市100049）

替米沙坦是一種特異性血管緊張素Ⅱ受體（AT1型）拮抗藥，可替代血管緊張素Ⅱ與AT1受體亞型（已知的血管緊張素Ⅱ作用位點）高親和性地結合，結合作用持久，且在AT1受體位點無任何激動藥效應，對其他受體（包括AT2和其他特征更少的AT受體）無親和力。其降壓效果好、副作用小，每日口服1次即可產(chǎn)生24 h持續(xù)降壓效果，是一種長效、高效、低毒的新型降壓藥。目前國內(nèi)外對生物樣本中替米沙坦的測定方法主要有高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜電噴霧法（LC-MS/MS）等，但這些方法都存在一定的局限性，如樣本處理過程復雜[1]、線性范圍較窄[2]、血漿用量較大[3～6]、檢測時間較長等。為了研究替米沙坦口服制劑的人體藥動學，評價其人體生物等效性，本試驗擬建立高效、靈敏、準確、專屬性強的LC-MS/MS法，以測定人血漿中替米沙坦?jié)舛取?/p>

1 材料

1.1 儀器

API3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源（ESI）以及Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件（美國Applied Biosystems公司）；Prom inence 20A液相色譜儀，包括LC-20AD型二元泵、DGU-20A3型脫氣機、SIL-20A型自動進樣器、CTO-20A型柱溫箱、CBM-20A系統(tǒng)控制器（日本Shimadzu公司）；QB-600型高速振蕩混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；3-18K臺式高速離心機（德國Sartorius Stedim Biotech公司）。

1.2 試藥

受試制劑：替米沙坦片（北京萬生藥業(yè)有限責任公司研制并提供，規(guī)格：每片80mg，含量：99.8%）；參比制劑：替米沙坦片（商品名：美卡素，上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，北京萬生藥業(yè)有限責任公司提供；規(guī)格：每片80mg，含量：99.8%）；替米沙坦對照品（純度：99.3%，批號：100629-200401）、克拉霉素對照品（純度：99.0%，批號：130558-200501）均由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純?？瞻兹搜獫{由航天中心醫(yī)院提供或來自于健康受試者。

2 方法與結果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

預柱：Phenomenex C18保護柱（4.0mm×3.0mm，5μm）；色譜柱：Zorbax SB-C18Narrow Bore柱（150mm×2.1mm，5μm）；流動相：甲醇-10mmol·L－1乙酸銨（含0.5%甲酸）（80∶20）；流速：0.4m L·min－1；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

離子源：電噴霧離子化源；離子噴射電壓：1 800 V；溫度：550 ℃；源內(nèi)氣體 1（GS1，N2）壓力：40 psi；氣體2（GS2，N2）壓力：65 psi；氣簾氣體（N2）壓力：20 psi；正離子方式監(jiān)測；掃描方式：多重反應監(jiān)測（MRM）；用于定量分析的離子反應分別為m/z515.2→276.2（替米沙坦）和m/z 748.5→158.2（克拉霉素）；解簇電壓（DP）分別為93 V和45 V；碰撞能量（CE）分別為56 eV和35 eV；碰撞氣（CAD，N2）壓力：3 psi；Q1和Q3分辨率均為UNIT。

2.2 試驗溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液：準確稱取替米沙坦對照品5.04mg（相當于替米沙坦5.00mg），置于10m L容量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，配制成相當于替米沙坦500μg·m L－1的母液。精確取替米沙坦母液1m L于5m L容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成濃度為100μg·m L－1的替米沙坦貯備液。

2.2.2 質(zhì)控（QC）溶液：取適量替米沙坦貯備液，用乙腈稀釋成濃度分別為15.0、300、6 000 ng·m L－1的QC溶液。

2.2.3 標準曲線樣本：分別取適量替米沙坦貯備液，用空白血漿稀釋成濃度分別為1.00、3.00、12.0、60.0、200、1 200和1 500 ng·m L－1的標準曲線樣本。

2.2.4 QC樣本：分別取適量替米沙坦貯備液，用空白血漿稀釋成濃度分別為3.00、60.0、1 200 ng·m L－1的QC樣本。

2.2.5 內(nèi)標溶液：準確稱取5.05mg克拉霉素對照品（相當于克拉霉素5.00mg）于5m L容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制成濃度為1.00mg·m L－1的克拉霉素母液。精確取40μL克拉霉素母液于10m L容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成克拉霉素濃度為4.00μg·m L－1的內(nèi)標溶液，于4℃冰箱中保存。

2.3 血漿樣本處理

取血漿50μL，分別加入內(nèi)標溶液10μL、乙腈390μL，渦旋1m in，10 000 r·m in－1離心10m in，取全部上清液轉(zhuǎn)移至另一個干凈1.5m L塑料離心管，加入150μL純水，渦旋1m in，取200μL于進樣瓶中進行LC-MS/MS分析。

2.4 方法驗證

2.4.1 質(zhì)譜分析：用蠕動泵分別將替米沙坦的乙腈溶液（1.00μg·m L－1）和克拉霉素的乙腈溶液（1.00 μg·m L－1）以5 μL·m in－1的恒定流速泵入MS/MS系統(tǒng)，相應的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖1。

2.4.2 專屬性：分別取6個不同來源的空白血漿各50μL，以等體積的乙腈代替內(nèi)標溶液，按“2.3”項下方法操作，得色譜圖（其中1名受試者空白血漿樣本提取后色譜圖見2A）；取替米沙坦?jié)舛葹?.00 ng·m L－1標準曲線樣本50 μL，按“2.3”項下方法操作，得色譜圖2B；取1名受試者給藥后收集的血漿樣本，按“2.3”項下方法操作，得色譜圖2C。結果表明，替米沙坦和內(nèi)標克拉霉素的保留時間分別約為1.51m in和1.25m in，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾替米沙坦和克拉霉素的測定。

2.4.3 基質(zhì)效應：取空白血漿（6個不同來源）50μL，以等體積的乙腈代替內(nèi)標溶液，按“2.3”項下方法操作，取離心后全部上清液至另一干凈1.5m L塑料離心管中，分別加入低、中、高3個

濃度（分別為15.0、300、6 000 ng·m L－1）的QC溶液10 μL、內(nèi)標溶液10μL、純水150μL，渦旋后取200μL于進樣瓶中進行LC-MS/MS分析，每濃度6樣本，獲得替米沙坦和克拉霉素的峰面積。同時以40μL純水代替50μL空白血漿（按“2.3”項下方法操作時50μL血漿產(chǎn)生沉淀的體積約10μL），加入乙腈400 μL后，分別加入低、中、高3個濃度（分別為15.0、300、6 000 ng·m L－1）的QC溶液10 μL、內(nèi)標溶液10μL、純水150 μL，渦旋后取200μL于進樣瓶中進行LC-MS/MS分析，每濃度6個樣本，獲得替米沙坦和克拉霉素的峰面積。以每一濃度前種處理方法所得替米沙坦的峰面積（各6個樣本）除以后種處理方法所得替米沙坦的平均峰面積（每濃度6個測定值的平均值），計算其基質(zhì)效應。結果，低、中、高3個濃度血漿樣本中替米沙坦的基質(zhì)效應分別為（124.4±4.9）%，（122.5±4.3）%和（118.5±1.3）%，平均基質(zhì)效應為（121.8±4.4）%。以前種處理方法所得克拉霉素峰面積（共18個樣本）除以后種處理方法所得克拉霉素的平均峰面積（18個測定值的平均值），計算其基質(zhì)效應。結果，血漿樣本中克拉霉素的基質(zhì)效應為（107.3±3.0）%。

2.4.4 標準曲線和定量下限：取“2.2.3”項下標準曲線樣本50 μL，按“2.3”項下方法操作，記錄色譜。以血漿中待測物濃度為橫坐標（X），待測物與內(nèi)標的峰面積比值（Y）為縱坐標，用加權（W＝1/X2）最小二乘法進行回歸運算，求得的直線回歸方程，即為工作曲線。每個分析批建立1條工作曲線，每濃度2個樣本，連續(xù)測定3個分析批。典型曲線回歸方程為：Y＝0.003 13 X+0.000 382（r＝0.998 5）。結果說明，替米沙坦血藥濃度在1.00～1500 ng·m L－1范圍內(nèi)線性關系良好。另按“2.3”項下方法操作，處理替米沙坦?jié)舛葹?.00 ng·m L－1的樣本，每個分析批6樣本，連續(xù)測定3個分析批，以相應分析批的工作曲線計算樣本的濃度，根據(jù)測定結果計算樣本的相對誤差（RE），及日內(nèi)、日間RSD。結果，RE在±15%以內(nèi)，日內(nèi)、日間RSD均＜20%，因此定量下限為1.00 ng·m L－1。

2.4.5 準確度與精密度：按“2.3”項下方法操作，處理替米沙坦低、中、高3個濃度（分別為3.00、60.0、1 200 ng·m L－1）的QC樣本，每濃度6樣本，連續(xù)測定3個分析批，以同一分析批的工作曲線計算QC樣本的濃度，根據(jù)QC樣本的測定結果計算方法的準確度與精密度。結果，RE均在±15%以內(nèi)，日內(nèi)、日間RSD均＜15%。準確度及精密度試驗結果見表1。

2.4.6 提取回收率：按“2.3”項下方法操作，處理替米沙坦低、中、高3個濃度（分別為3.00、60.0、1 200 ng·m L－1）的QC樣本，取離心后全部上清液體至另一干凈1.5m L塑料離心管中，加入乙腈20μL、純水150μL，渦旋后取200μL于進樣瓶中進行LC-MS/MS分析，每濃度6樣本，獲得替米沙坦和克拉霉素的峰面積。同時另取空白血漿50μL，以等體積的乙腈代替內(nèi)標溶液，按“2.3”項下方法操作，取離心后全部上清液至另一干凈1.5m L塑料離心管中，分別加入低、中、高3個濃度（分別為15.0、300、6 000 ng·m L－1）的QC溶液10 μL、內(nèi)標溶液10 μL、純水150μL，渦旋后取200μL于進樣瓶中進行LC-MS/MS分析，每濃度6樣本，獲得替米沙坦和克拉霉素的峰面積。以每一濃度前種處理方法所得替米沙坦的峰面積（各6個樣本）除以后種處理方法所得替米沙坦的平均峰面積（每濃度6個測定值的平均值），計算其提取回收率。結果低、中、高3個濃度血漿樣品中替米沙坦的提取回收率分別為（92.5±5.3）%、（95.4±2.3）%和（91.1±2.4）%，平均提取回收率為（93.0±3.9）%。以前種處理方法所得克拉霉素峰面積（共18個樣本）除以后種處理方法所得克拉霉素的平均峰面積（18個測定值的平均值），計算其提取回收率。結果血漿樣品中克拉霉素的提取回收率為（96.2±3.2）%。

表1 準確度及精密度試驗結果（n＝18）Tab 1 Resultsof precision and accuracy tests（n＝18）

2.4.7 穩(wěn)定性試驗：取QC樣本50μL，分別考察血漿樣本室溫放置8 h、反復凍融3次、－80℃冰凍放置1個月以及血漿樣本經(jīng)處理后于自動進樣器中室溫放置24 h后替米沙坦的穩(wěn)定性，每濃度3樣本。結果，測定濃度與理論濃度的RE均在±11%以內(nèi)，表明在血漿樣本室溫放置、反復凍融3次、長期－80℃冰凍放置以及處理后分析測定過程中，替米沙坦均較為穩(wěn)定，各貯存條件不影響對樣本濃度進行準確測定。穩(wěn)定性試驗結果見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結果（n＝3）Tab 2 Resultsof stability tests（n＝3）

2.5 方法應用

2.5.1 受試者的選擇：22名男性受試者，年齡（25±3）歲，體重（63.1±7.0）kg。試驗前體格檢查、實驗室檢查（血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、血糖、乙型肝炎表面抗原、梅毒、艾滋病抗體）、心電圖檢查、胸片檢查均合格。受試者無過敏體質(zhì)、藥物過敏史、暈針史，試驗前2周內(nèi)未用任何的藥物。試驗前均簽署知情同意書。

2.5.2 給藥方案及血樣采集：根據(jù)國內(nèi)、外已上市替米沙坦片的說明書，本試驗采用臨床常用劑量（80mg）。采用隨機雙周期自身交叉對照試驗設計，口服替米沙坦片受試制劑和參比制劑。每名受試者分2周期口服受試制劑和參比制劑各1次，間隔時間為2周。受試者于試驗前1天下午入住藥物臨床試驗病房，吃清淡晚餐（18∶00～19∶00）后禁食不禁水；第2天早上8∶00點左右，由醫(yī)護人員發(fā)放受試制劑或參比制劑，受試者空腹服藥，用200m L溫開水送服。用藥后保持上身直立狀態(tài)2 h，其后可自由飲水，4 h統(tǒng)一進食標準餐。試驗過程中，禁用其他藥物或含咖啡因類成分的飲料，禁止吸煙、飲酒，按時休息，避免劇烈活動。受試者于用藥前0 h及用藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96 h時于肘靜脈取血約2m L，3 000 r·min－1離心10min，取血漿，立即置－80 ℃冰箱中保存，備測。

2.5.3 生物等效性評價：22名志愿者口服替米沙坦片受試制劑和參比制劑后，平均藥-時曲線見圖3。主要藥代動力學參數(shù)分別為cmax（358±212）ng·m L－1和（389±298）ng·m L－1，tmax（1.50±0.78）h和（1.59±1.16）h，t1/2（25.5±12.5）h和（26.5±11.8）h，AUC0～96h（2 383±11 46）ng·h·m L－1和（2 411±1 192）ng·h·m L－1，AUC0～∞（2 513±1 194）ng·h·m L－1和（2 555±1 255）ng·h·m L－1。替米沙坦片受試制劑的平均相對生物利用度為（101.6±22.8）%（以 AUC0～t計）、（101.3±22.6）%（以AUC0～∞計）。主要藥動學參數(shù)cmax、AUC0～t、AUC0～∞對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行方差分析、雙向單側(cè)t檢驗和90%置信區(qū)間計算，tmax采用配對Wilcoxon法檢驗，結果表明2種制劑具有生物等效性。

2.6 不良反應

本試驗共發(fā)生6人8例/次不良事件，其中2人3例/次與試驗用藥可能有關，判斷為不良反應。所有不良事件均為輕度，未經(jīng)處理1～2周后恢復正常。

3 討論

本研究建立選擇性好、靈敏度高、高通量的LC-MS/MS法測定人血漿中替米沙坦，并進行了系統(tǒng)的方法驗證。沉淀蛋白前處理方法簡單快速，優(yōu)化后的色譜條件極大縮短了檢測時間，每個樣本分析僅需2.2m in，提高了工作效率。本方法血漿用量少（僅50μL），定量下限（LLOQ）為1.00 ng·m L－1，定量上限定為1 500 ng·m L－1，線性范圍較寬，能夠滿足替米沙坦片的人體藥動學研究及生物等效性研究的需要。

[1]劉世坤，劉玉蘭，彭向東，等.HPLC-MS法研究替米沙坦人體藥動學和生物等效性[J].藥物分析雜志，2005，25（5）：519

[2]孫 黎，沈金芳，陶達人，等.高效液相色譜法測定替米沙坦血藥濃度[J].中國新藥雜志，2006，15（14）：1 210.

[3]侯飛燕，黃 平，譚志榮，等.替米沙坦的人體生物等效性研究[J].中國藥房，2006，17（4）：282.

[4]武 潔，馮 芳，蔣娟娟，等.HPLC-MS法測定人血漿中替米沙坦及藥代動力學研究[J].中國藥科大學學報，2004，35（6）：545.

[5]金曉玲，高守紅，鄔 蓉，等.LC-MS/MS測定人血漿中替米沙坦的濃度[J].第二軍醫(yī)大學學報，2008，12（29）：1 525.

[6]譚文明，劉 燦，黃 荻，等.人血漿中替米沙坦的LCMS法快速測定及其制劑的生物等效性研究[J].藥學進展，2005，29（2）：78.