懷牛膝藥材的HPLC指紋圖譜研究Δ

趙變，常珍珍，史彪，孫祥德（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，新鄉(xiāng)市453003）

四大懷藥包括牛膝、地黃、山藥、菊花，是著名的河南道地藥材，產(chǎn)于焦作。其中，牛膝為莧科植物牛膝Achyranthes bidentataBl.的干燥根，味苦、甘，性平，歸肝、腎經(jīng)。能補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、逐瘀通經(jīng)、引血下行，用于治療腰膝酸痛、筋骨無(wú)力、肝陽(yáng)眩暈[1]等證。2010年版《中國(guó)藥典》（一部）中將牛膝類藥材分為牛膝和川牛膝2種收錄?，F(xiàn)代中藥化學(xué)和藥理學(xué)研究表明，牛膝中含有皂苷類[2]、植物甾酮類[3]、糖類[4]、黃酮類等化學(xué)成分。人們對(duì)牛膝的藥理、毒理及其化學(xué)成分等方面的研究逐漸深入，但尚缺少綜合評(píng)價(jià)藥材品質(zhì)的方法和標(biāo)準(zhǔn)。目前，通過(guò)建立指紋圖譜來(lái)控制中藥的質(zhì)量已成為越來(lái)越多人的共識(shí)[5]，但有關(guān)懷牛膝的指紋圖譜研究少見(jiàn)報(bào)道，僅有的文獻(xiàn)方法[6]存在組分峰相對(duì)較小、分離度不高、未經(jīng)相似度評(píng)價(jià)等不足。因此，本試驗(yàn)采用高效液相色譜（HPLC）法建立了懷牛膝原藥材和經(jīng)硫磺熏制過(guò)的懷牛膝藥材的指紋圖譜，并進(jìn)行了相似度比較，以期為該藥材的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

SHIMADZU LC-6AD型HPLC儀、SPD-20A型紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；FA2004型分析天平（上海良品儀器有限公司）；超聲波清洗器（工作頻率：59 kHz，功率：45 W，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

甲醇（色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司）；冰醋酸（分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司）；5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：A0298，純度＞99%）、蛻皮甾酮標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：A0217，純度＞99%）均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；試驗(yàn)所用原藥材和熏制藥材均購(gòu)自河南道地產(chǎn)區(qū)GAP示范基地，并經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院中藥學(xué)教研室荊云副教授鑒定為真品（藥材來(lái)源見(jiàn)表1），將藥材粉碎，過(guò)二號(hào)篩，置廣口瓶中密塞備用[硫磺熏制方法：將藥農(nóng)初加工后牛膝放入缸內(nèi)，反復(fù)沖水洗凈泥土，放入牛膝焙中，點(diǎn)燃硫磺鍋，用草苔覆蓋，按每100 kg牛膝用硫磺2 kg熏制8 h；然后用大鍋將水溫成100℃，把牛膝帶莖端（莖下3 cm）用水沖洗1 min后悶放2 h，再?zèng)_清水，放入牛膝焙中，按每100 kg牛膝用硫磺1 kg熏蒸6 h]。

表1 藥材來(lái)源Tab 1 The origin of medicinal samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SHIMADZU shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%醋酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min：A∶B＝0∶100；45 min：A∶B＝45∶55；55～65 min：A∶B＝70∶30）；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：279 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取蛻皮甾酮標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，精密稱定，以甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中含1.0 mg的蛻皮甾酮標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，備用。取5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品11 mg，精密稱定，以甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中含1.0 mg的5-羥甲基糠醛標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取懷牛膝樣品粉末（過(guò)四號(hào)篩）2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱重，超聲提取1 h，冷卻后補(bǔ)足重量，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 對(duì)照試驗(yàn) 分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各20 μL，注入HPLC儀，記錄80 min內(nèi)的色譜峰。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取一新制備的供試品溶液適量，在上述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間基本一致。對(duì)測(cè)定結(jié)果以相似度軟件進(jìn)行計(jì)算，可得相似度分別為0.990、0.992、0.994、0.985、0.991，均＞0.98，RSD＝0.34%（n＝5），表明本方法精密度較好，符合指紋圖譜技術(shù)要求。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一新制備的供試品溶液適量，在上述色譜條件下分別于0、2、4、6、12、24、48 h進(jìn)樣，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間基本一致。對(duì)測(cè)定結(jié)果以相似度軟件進(jìn)行計(jì)算，可得相似度分別為0.989、0.991、0.994、0.990、0.986、0.992、0.994，均＞0.98，RSD＝0.29%（n＝7），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材適量，共6份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間基本一致。對(duì)測(cè)定結(jié)果以相似度軟件進(jìn)行計(jì)算，可得相似度分別為 0.974、0.984、0.999、0.997、0.998、0.985，RSD＝1.02%（n＝6），表明本方法重復(fù)性較好。

2.5 懷牛膝藥材指紋圖譜的建立[7]

2.5.1 懷牛膝原藥材指紋圖譜的建立 取12批懷牛膝原藥材供試品溶液各20 μL分別進(jìn)樣，所得HPLC圖譜以AIA格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”軟件，得到12批懷牛膝原藥材的HPLC指紋圖譜疊加圖，詳見(jiàn)圖2A。

2.5.2 經(jīng)硫磺熏制過(guò)的懷牛膝藥材指紋圖譜的建立 按“2.5.1”項(xiàng)下方法處理11批經(jīng)硫磺熏制過(guò)的懷牛膝樣品，得到經(jīng)硫磺熏制過(guò)的懷牛膝藥材的HPLC指紋圖譜疊加圖，詳見(jiàn)圖2B。

圖2 HPLC指紋圖譜疊加圖Fig 2 HPLC fingerprints

2.5.3 相似度分析 運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”軟件將各藥材的指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，生成指紋圖譜的共有模式即為對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算各樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度。12批懷牛膝藥材與11批經(jīng)硫磺熏制過(guò)的懷牛膝藥材的相似度見(jiàn)表2。以蛻皮甾酮峰為內(nèi)參比峰，計(jì)算各共有峰與內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3～表6。

表2 12批懷牛膝藥材和11批經(jīng)硫磺熏制過(guò)的懷牛膝藥材的相似度Tab 2 Similarities of 12 batches ofA.bientata and 11 batches ofA.bientata fumigated by sulphur

表3 12批懷牛膝原藥材樣品指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab 3 Relative retention time of the common peaks of fingerprints of 12 batches ofA.bientata

3 討論

本試驗(yàn)建立了懷牛膝藥材的HPLC指紋圖譜，并首次建立了經(jīng)硫磺熏制過(guò)的懷牛膝的指紋圖譜，為懷牛膝藥材的質(zhì)量控制提供了新的依據(jù)。原藥材中標(biāo)定了24個(gè)共有峰，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照指認(rèn)了2個(gè)色譜峰，其中9號(hào)峰為5-羥甲基糠醛，18號(hào)峰為蛻皮甾酮（見(jiàn)圖1C）。

運(yùn)用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）”軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表明，12批原藥材中，9批藥材的相似度均在0.9以上，證明懷牛膝藥材的相似度較高，其所含化學(xué)成分有較高的相似性；第5、9、10批樣品的相似度在0.9以下，這可能是由于土壤環(huán)境（如砂土、爐土、混合土等不同土質(zhì)）以及不同農(nóng)戶施肥情況不同，導(dǎo)致其部分成分的含量有差異。

表4 12批懷牛膝原藥材樣品指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積Tab 4 Relative peak areas of the common peaks of fingerprints of 12 batches ofA.bientata

為了便于保存，且使其色澤好看，藥商常將收購(gòu)的中藥飲片或原藥材進(jìn)行硫磺熏制處理。用硫磺熏制過(guò)的中藥或多或少地含有硫磺化合物，這不僅不衛(wèi)生，還可能對(duì)人體有毒害[8]。試驗(yàn)表明，懷牛膝原藥材和經(jīng)硫磺熏制過(guò)的藥材有很大差異：在相同的試驗(yàn)條件下，經(jīng)硫磺熏制過(guò)的樣品不僅整體出峰較高，而且在前30 min內(nèi)組分色譜峰數(shù)目明顯增多，說(shuō)明懷牛膝藥材經(jīng)硫磺熏制以后不僅化學(xué)成分的量發(fā)生了改變，而且在硫磺的作用下原有組分發(fā)生了化學(xué)作用，產(chǎn)生了新的物質(zhì)。如，原藥材圖譜中8～13號(hào)之間的峰對(duì)應(yīng)硫磺熏制藥材中7～11號(hào)之間的峰，可見(jiàn)硫磺熏制藥材的峰明顯增高。相似度結(jié)果也表明，11批經(jīng)硫磺熏制過(guò)的懷牛膝藥材的整體相似度下降，其中有4批相似度在0.8以下，說(shuō)明藥材經(jīng)硫磺熏制后其組分的種類和量的變化程度不一，難以控制。11批硫磺熏制藥材中標(biāo)定了20個(gè)共有峰，其中被指認(rèn)出的5-羥甲基糠醛峰在硫磺熏制后增加尤其明顯。5-羥甲基糠醛會(huì)對(duì)人的橫紋肌造成一定的傷害，《中國(guó)藥典》對(duì)部分中藥材中5-羥甲基糠醛有含量限度規(guī)定，所以在對(duì)懷牛膝進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善時(shí)亦應(yīng)增加對(duì)5-羥甲基糠醛含量的限量標(biāo)準(zhǔn)，以確保藥材的質(zhì)量符合臨床用藥要求。

表5 11批經(jīng)硫磺熏制過(guò)的樣品指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間Tab 5 Relative retention time of the common peaks of fingerprints of 11 batches ofA.bientata fumigated by sulphur

試驗(yàn)比較了回流、索氏、超聲3種樣品提取方法，結(jié)果表明，3種方法的提取效果接近，因此選用操作更為簡(jiǎn)便、省時(shí)的超聲提取法。再對(duì)不同提取時(shí)間（30、60、120 min）、不同醇濃度（50%甲醇、80%甲醇、100%甲醇、95%乙醇、50%乙醇、正丁醇）進(jìn)行了比較，最終確定以50%甲醇超聲60 min作為供試品溶液的制備方法，所得色譜峰峰數(shù)多、峰面積大、整體基線好。

表6 11批經(jīng)硫磺熏制過(guò)的樣品指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積Tab 6 Relative peak areas of the common peaks of fingerprints of 11 batches ofA.bientata fumigated by sulphur

在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)供試品溶液進(jìn)行掃描后，選擇出峰較好的220、230、245、279 nm等波長(zhǎng)條件進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在279 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)不但出峰最多，且整體信號(hào)較強(qiáng)，因此選擇279 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

試驗(yàn)考察了甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%醋酸水溶液等不同的流動(dòng)相系統(tǒng)。結(jié)果表明，以甲醇-0.1%醋酸水溶液作流動(dòng)相時(shí)色譜峰的基線平穩(wěn)、峰形及分離度都較好，故選其作為流動(dòng)相。

隨著溫度的提高，各峰的保留時(shí)間會(huì)前移，但對(duì)峰數(shù)和分離度影響不大。綜合各因素，選擇30℃為柱溫條件。

在本文建立的色譜條件下，所建指紋圖譜較文獻(xiàn)方法[6]出峰多，且共有峰也較多，可為懷牛膝的全面質(zhì)量控制提供更可靠的參考依據(jù)。

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