HPLC法測(cè)定雞嗉子葉中3種黃酮苷的含量

字 剛,丁中濤

(1.云南省藥物研究所制劑研究中心,云南 昆明 650111;2.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院,云南 昆明 650091)

雞嗉子葉為山茱萸科植物頭狀四照花[Dendrobenthamia capitata(Wall.)Hutch.]的葉,功能消積殺蟲,消腫解毒,利水消腫。主治食積、小兒疳積、蟲積腹痛、肝炎、腹水、水火燙傷、外傷出血、瘡瘍。雞嗉子葉是彝族習(xí)用藥,臨床應(yīng)用已有較長(zhǎng)的歷史[1]。

該藥材收載于《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2005年版第4冊(cè)?彝族藥),無含量測(cè)定方法。筆者建立了金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷3種黃酮苷的含量測(cè)定方法,為控制雞嗉子葉藥材的質(zhì)量提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)儀器和試藥

1.1 儀器 美國Agilent 1100高效液相色譜儀,Mettler AE163電子天平,HS6150D超聲清洗儀。

1.2 試劑和藥材 雞嗉子葉:分別來源于昆明西山090406,楚雄090510,大理090512(經(jīng)云南省藥物研究所生藥室鑒定為山茱萸科植物雞嗉子);標(biāo)準(zhǔn)品:金絲桃苷和槲皮苷對(duì)照品為中國藥品生物制品檢定所提供,批號(hào):金絲桃苷111521-200303(供含量測(cè)定);槲皮苷 111538-200403(供含量測(cè)定)。異槲皮苷為自制對(duì)照品,經(jīng)HPLC檢測(cè),純度大于98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Hanbon Lichrospher C18柱(4.6×150 mm,5 μ m),流動(dòng)相 A:0.2%磷酸溶液B:甲醇,按表 1進(jìn)行梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為352 nm,在此條件下金絲桃苷,異槲皮苷和槲皮苷對(duì)照品溶液及供試品溶液的色譜圖如圖1所示被測(cè)組分分離度均達(dá)到1.5以上,理論塔板數(shù)均不低于5000。

表1 流動(dòng)相洗脫梯度

圖1 色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取60℃減壓干燥2 h的金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷對(duì)照品適量,置容量瓶?jī)?nèi),加甲醇適量,超聲處理使溶解,放冷,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,即得,每 1 mL 含金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷分別為 80μg、50μg、60μg 。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取雞嗉子葉藥材細(xì)粉1.0 g,精密加入甲醇50 mL,精密稱重,加熱回流提取 2 h,放冷,補(bǔ)足缺失重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.4 線性關(guān)系 精密稱取在60℃減壓干燥2 h的金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷對(duì)照品 10.37 mg、8.51 mg、5.90 mg置 10 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,制得7#混合對(duì)照品溶液,精密吸取對(duì)照品溶液 2.5 mL、2.5 mL、1 mL分別置5 mL、10 mL、10 mL的容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得 6#、5#、4#溶液,精密吸取 4#溶液 2.5 mL、1 mL、1 mL分別置5 mL、5 mL、10 mL的容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得3#、2#、1#溶液。分別進(jìn)樣10 μ L,測(cè)定,結(jié)果以濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X),面積為縱坐標(biāo)(Y),得回歸方程,見表2。

表2 線性關(guān)系測(cè)定結(jié)果

2.5 精密度試驗(yàn) 取配制好的混合對(duì)照品溶液按照含量測(cè)定方法依法測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6針,以峰面積計(jì)算,結(jié)果3個(gè)組分的RSD均小于2%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批供試品,按照制備方法同時(shí)制成6份供試液,進(jìn)樣10μ L,測(cè)定。按2.4下所得回歸方程分別計(jì)算含量,結(jié)果3個(gè)組分的RSD均小于3%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取已配制好的供試品溶液按照含量測(cè)定方法依法測(cè)定,分別于0,1,3,6,12,24 h進(jìn)樣,進(jìn)樣10 μ L,以峰面積計(jì)算,結(jié)果3個(gè)組分的RSD均小于3%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 分別取已知金絲桃苷,異槲皮苷和槲皮苷含量的供試品6份,分別加入金絲桃苷,異槲皮苷和槲皮苷的濃度為1.99 mg/mL,1.80 mg/mL,2.02 mg/mL的混合對(duì)照品溶液各1 mL,然后按確定好的樣品前處理方法同法制備,按供試品溶液的含量測(cè)定方法依法測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表3～表5。

表3 金絲桃苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表4 異槲皮苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表5 槲皮苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定 樣品3批,分別依2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液,依法測(cè)定金絲桃苷,異槲皮苷和槲皮苷含量,結(jié)果見表 6。

表6 樣品含量測(cè)定

3 小結(jié)

據(jù)現(xiàn)代文獻(xiàn)報(bào)道,雞嗉子葉和皮中含有黃酮類、三萜、環(huán)烯醚萜類、甾醇、多酚類和有機(jī)酸類化合物[2],筆者在對(duì)其化學(xué)成分研究過程中發(fā)現(xiàn)雞嗉子葉中含有多種黃酮類化合物,金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷的含量較其他黃酮類成分要高,選用以上3種組分作為指標(biāo)物,采用高效液相色譜法對(duì)雞嗉子葉中黃酮類成分進(jìn)行含量測(cè)定研究。

以甲醇、乙醇、50%甲醇為溶劑考察黃酮苷的提取方法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)以甲醇為溶劑,加熱回流2 h雞嗉子葉中金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷3種組分提取率最高,提取較完全。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999:743～744.

[2]田雅娟,羅應(yīng)剛,李伯剛,等.山荔枝化學(xué)成分的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2002,14(3):18～20.