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    辛伐他汀對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞分泌趨化因子的影響及其機制*

    2011-08-02 07:38:50陳偉玲梁柳琴葉玉津詹鐘平
    中國病理生理雜志 2011年10期
    關(guān)鍵詞:趨化因子辛伐他汀滑膜

    陳偉玲, 梁柳琴, 邱 茜, 葉玉津, 詹鐘平

    (中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫內(nèi)科,廣東 廣州 510080)

    類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥和關(guān)節(jié)破壞為主要特點的系統(tǒng)性自身免疫性疾病,但發(fā)病機制尚不清楚[1]。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte,F(xiàn)LS)及其分泌的炎癥細(xì)胞因子在RA滑膜炎的發(fā)生和發(fā)展中具有關(guān)鍵性的作用。目前已在RA關(guān)節(jié)滑膜組織和滑液中檢測到多種趨化因子。趨化因子除促進(jìn)外周血白細(xì)胞遷徙至關(guān)節(jié)組織內(nèi)外,還對滑膜細(xì)胞活化、細(xì)胞增殖和血管新生具有重要的調(diào)節(jié)作用[2],因此,趨化因子很可能是RA治療的新靶點。FLS和單核巨噬細(xì)胞是分泌趨化因子的主要細(xì)胞[2,3]。

    近年研究發(fā)現(xiàn),他汀類降脂藥除有降脂作用外,還具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[4,5]。愈來愈多的證據(jù)表明,他汀類藥物對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病具有治療作用。多個臨床研究發(fā)現(xiàn),他汀類藥物能顯著改善RA患者癥狀和疾病活動程度[6-8]。動物實驗也證實該類藥物能抑制關(guān)節(jié)炎癥和破壞[9,10]。但他汀類藥物治療RA的確切機制仍未完全清楚。為此,本文將觀察在RA患者FLS中,經(jīng)典的他汀類藥物辛伐他汀(simvastatin,SMV)對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS分泌趨化因子的影響,并進(jìn)一步探討其信號調(diào)控機制。

    材料和方法

    1 研究對象

    17例RA患者均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(American College of Rheumatology,ACR)1987年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[11],其中女性15例,男性2例,除3名患者外,其他患者均用過激素(≤10 mg/d)和慢作用藥物,但均未用過生物制劑。

    2 FLS分離和培養(yǎng)

    滑膜組織取自行關(guān)節(jié)鏡和關(guān)節(jié)置換的RA患者。無菌條件下,將滑膜組織移至60 mm培養(yǎng)皿中,用眼科剪將其剪成碎屑,加入1g/L I型膠原酶,充分混勻后將其置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4-6 h。用孔直徑約為10 μm的細(xì)胞篩網(wǎng)(每個)過濾碎屑,濾過的液體轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中;常溫下離心5 min,吸去上清,加入 5 mL含 20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基,并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。約24 h后FLS黏附于培養(yǎng)瓶壁上,此時可換成含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。用第3-5代的細(xì)胞進(jìn)行實驗。根據(jù)實驗需要,分別用辛伐他汀(1 μmol/L)、腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor,TNF-α,10 μg/L)、HMG-CoA 途徑代謝產(chǎn)物甲羥戊酸(mevalonate,MEVA,200 μmol/L)和焦磷酸香葉基香葉酯 (geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP,10 μmol/L)及 C3轉(zhuǎn)移酶(C3-transferase,一種 RhoA抑制劑,20 mg/L)處理FLS。同時,用臺盼藍(lán)拒染法檢測細(xì)胞活性,細(xì)胞活性超過95%。

    3 提取細(xì)胞總蛋白

    用冷1×PBS洗滌細(xì)胞1次,加入50 μL SDS樣本裂解緩沖液A[50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5),10 mmol/L MgCl2,500 mmol/L NaCl,1%Triton X-100,0.5%去氧膽酸鈉,0.1%SDS,1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF),10 mg/L亮抑肽酶,10 mg/L抑肽酶],勻漿后置冰上,超聲粉碎10-15 s,于95-100℃煮5 min,然后置冰上;4℃ 12000 r/min離心5 min,吸取上清,分裝儲存于-20℃。

    4 RhoA活性檢測

    采用pull-down方法檢測。把培養(yǎng)的各組類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS用裂解緩沖液A于冰上裂解,離心后把等體積的細(xì)胞裂解物上清與20 μg GST-RBD珠(Upstate)于4℃孵育45 min,然后用Tris緩沖液洗滌3次。把已與Rho蛋白結(jié)合區(qū)域(Rho-binding domain,RBD)結(jié)合的珠用RhoA單抗經(jīng)免疫印跡法檢測。

    5 免疫印跡法

    把樣品蛋白于95-100℃煮5 min,然后等量上樣于15%SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳,開始電壓為90 V,溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠層時調(diào)至120 V,待溴酚藍(lán)接近至凝膠底部時停止電泳[電泳緩沖液為1×Tris-甘氨酸緩沖液(pH7.9)],用轉(zhuǎn)移緩沖液把凝膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上,膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h,然后膜與不同濃度Ⅰ抗(RhoA 為1∶500,β -肌動蛋白為 1∶2000,均購自Santa Cruz)于4℃孵育過夜,接著膜在室溫下與Ⅱ抗(為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗小鼠IgG,1∶2000,購自Santa Cruz)孵育1 h,TBST洗膜后用ECL液顯影,最后將結(jié)果進(jìn)行圖像分析,計算吸光度(A)值。

    6 細(xì)胞活性測定

    FLS活性采用四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法測定。為檢測細(xì)胞活性,將實驗分為4組:單獨無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)組、TNF-α組、TNF-α +1 μmol/L SMV 組、TNF- α +20 mg/L C3轉(zhuǎn)移酶,每組均設(shè)3個復(fù)孔。把1×104類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS在含100 μL培養(yǎng)液的96孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)72 h,用前列腺素(prostaglandin,PG)刺激前先用C3轉(zhuǎn)移酶預(yù)處理細(xì)胞3 h。MTT比色法具體步驟參見文獻(xiàn)[12]。

    7 趨化因子濃度檢測

    FLS培養(yǎng)上清 IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)分泌水平用ELISA方法檢測,按廠家提供的步驟進(jìn)行操作。

    8 統(tǒng)計學(xué)處理

    結(jié) 果

    1 辛伐他汀對TNF-α誘導(dǎo)的趨化因子分泌的影響

    如圖1所示,未經(jīng)刺激的FLS僅分泌微量IL-8和 MCP-1,用 TNF-α(10 μg/L)刺激 24 h 后,F(xiàn)LS分泌上述趨化因子顯著增加。辛伐他汀顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1分泌,而且辛伐他汀的這種抑制作用可被HMG-CoA途徑代謝產(chǎn)物MEVA和GGPP逆轉(zhuǎn)。

    Figure 1.Inhibitory effect of simvastatin on TNF-α-induced secretion of IL-8(A)and MCP-1(B)in RA FLS..n=5.*P <0.05 vs basal;#P <0.05 vs TNF-α;△P<0.05 vs TNF-α +SMV.SMV:simvastatin;MEVA:mevalonate;GGPP:geranylgeranyl pyrophosphate.圖1 辛伐他汀對TNF-α誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS IL-8和MCP-1分泌的影響

    2 辛伐他汀對TNF-α誘導(dǎo)的RhoA活性的影響

    如圖2所示,用 TNF-α(10 μg/L)刺激體外培養(yǎng)的FLS 15 min,與只用無血清培養(yǎng)基孵育的未刺激組比較,其RhoA活化顯著增強,而總RhoA蛋白表達(dá)未受影響。辛伐他汀顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的RhoA活化,而辛伐他汀的這種抑制作用也能被MEVA和GGPP逆轉(zhuǎn)。

    3 RhoA抑制劑對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 FLS分泌趨化因子的影響

    為探討RhoA通路是否參與調(diào)控TNF-α誘導(dǎo)的趨化因子分泌,我們分別用RhoA特異性抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶(20 mg/L)與FLS預(yù)孵育3 h,然后用TNF-α(10 μg/L)刺激24 h。如圖3所示,RhoA抑制劑C3酶對TNF-α誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1分泌具有明顯抑制作用。

    Figure 2.Inhibitory effect of simvastatin on TNF-α-induced activation of RhoA in RA FLS..n=5.*P<0.05 vs basal;#P <0.05 vs TNF-α;△P <0.05 vs TNF-α +SMV.SMV:simvastatin;MEVA:mevalonate;GGPP:geranylgeranyl pyrophosphate.圖2 辛伐他汀對TNF-α誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS RhoA活性的影響

    Figure 3.Inhibitory effect of RhoA inhibitor on TNF-α-induced secretion of IL-8(A)and MCP-1(B)in RA FLS..n=5.*P<0.05 vs basal;#P<0.05 vs TNF-α.C3:C3-transferase.圖3 RhoA抑制劑對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 FLS分泌IL-8和MCP-1的影響

    4 辛伐他汀和RhoA抑制劑對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS活性的影響

    如圖4所示,辛伐他汀(1 μmol/L)、RhoA 特異性抑制劑C3轉(zhuǎn)移酶(20 mg/L)作用于FLS 24 h后其細(xì)胞活性沒有顯著影響。

    Figure 4.Effect of simvastatin and RhoA inhibitor on RA FLS viability..n=5.*P<0.05 vs basal.C3:C3-transferase;SMV:simvastatin.圖4 辛伐他汀和RhoA抑制劑對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS活性的影響

    討 論

    辛伐他汀是一種廣泛使用的經(jīng)典降脂藥,近年發(fā)現(xiàn)其具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。動物實驗和臨床研究提示,辛伐他汀對RA有較好的治療效果[6-10],但其確切的作用機制仍有待闡明。

    以往研究發(fā)現(xiàn),在單核細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞中,阿托伐他汀顯著抑制血管緊張素Ⅱ和TNF-α誘導(dǎo)的 MCP-1 和 IL-8 分泌[13,14]。本文發(fā)現(xiàn),辛伐他汀顯著抑制TNF-α刺激的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 FLS分泌IL-8和MCP-1等趨化因子分泌,而且這種抑制作用可被MEVA和GGPP所逆轉(zhuǎn)。由于趨化因子在RA的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用,因此,上述結(jié)果提示通過調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞分泌趨化因子可能是辛伐他汀有效治療RA的重要機制之一。因為HMG-CoA途徑產(chǎn)物MEVA和GGPP均能逆轉(zhuǎn)辛伐他汀對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS分泌趨化因子的抑制作用,提示辛伐他汀可能通過干擾細(xì)胞體內(nèi)異戊二烯化過程參與調(diào)控趨化因子分泌。

    RhoA蛋白屬于小分子GTP酶,具有多種生物學(xué)功能,不僅能調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、增殖、凋亡,而且在調(diào)控免疫反應(yīng)方面亦有重要作用[15]。對單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn),Rho蛋白是促炎因子產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)因子[16,17]。在 RA滑膜細(xì)胞中,RhoA也介導(dǎo)凝血酶(thrombin)誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和IL-6分泌[18]。本研究發(fā)現(xiàn),TNF-α能促進(jìn)RhoA活化,而RhoA抑制劑能顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的IL-8和MCP-1分泌,提示RhoA參與調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS產(chǎn)生趨化因子,在RA發(fā)病機制中起重要作用。

    近年大量研究表明,他汀類藥物可能通過調(diào)控Rho GTP酶活性參與調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)[13]。在RA滑膜細(xì)胞中,辛伐他汀通過調(diào)控RhoA活性抑制重要炎癥轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化和IL-1、IL-6等促炎細(xì)胞因子分泌[19]。本研究發(fā)現(xiàn),辛伐他汀不僅對TNF-α誘導(dǎo)的IL-8、MCP-1等有抑制作用,而且對RhoA活化也有顯著的抑制作用,提示辛伐他汀可能通過抑制RhoA活化調(diào)控類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS分泌趨化因子。

    為了解辛伐他汀和RhoA抑制劑C3轉(zhuǎn)化酶對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS分泌趨化因子的抑制作用是否與其細(xì)胞毒作用有關(guān),我們分別用辛伐他汀(1 μmol/L)和C3轉(zhuǎn)移酶(20 mg/L)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎FLS孵育,發(fā)現(xiàn)與對照組比較,辛伐他汀和C3轉(zhuǎn)化酶對細(xì)胞活性的影響無顯著差異,提示在本實驗所用濃度范圍內(nèi)辛伐他汀和C3轉(zhuǎn)移酶抑制細(xì)胞趨化因子分泌與其細(xì)胞毒作用無關(guān)。

    總之,本研究發(fā)現(xiàn)在RA中辛伐他汀通過調(diào)節(jié)RhoA信號通路活性抑制TNF-α誘導(dǎo)的FLS分泌IL-8和MCP-1等趨化因子,提示抑制滑膜細(xì)胞趨化因子分泌可能是辛伐他汀在RA中發(fā)揮作用的機制之一,RhoA也可能是RA潛在的一個治療靶點。

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