IL-17R在韋格納肉芽腫患者外周血免疫細胞的表達

姜 波,王 紅,劉布駿

(南京大學醫(yī)學院附屬南京鼓樓醫(yī)院風濕免疫科,江蘇南京,210008)

韋格納肉芽腫(WG)為一種累及全身多個器官包括上/下呼吸道和腎臟系統(tǒng)的壞死性肉芽腫血管炎,盡管在我國發(fā)病率不高,但嚴重影響患者的生活質(zhì)量及生存率。目前,WG的病理機制尚不明確。近年來研究發(fā)現(xiàn),新的T細胞亞群-IL-17產(chǎn)生細胞(Th17)在很多自身免疫病中有重要的參與作用。Th17不同于Th1和Th2,產(chǎn)生標志性的細胞因子IL-17,與細胞的表面受體-IL-17RA/RC結(jié)合,誘導中性粒細胞的募集及淋巴細胞的浸潤和活化而參與免疫反應。已發(fā)現(xiàn)IL-17在類風濕關(guān)節(jié)炎[1]、多發(fā)性硬化[2]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[3]、大動脈炎[4]和炎性腸病[5]患者中的表達顯著升高。Abdulahad等研究表明,與正常人相比,WG患者外周血Th17(IL-4、IL-17、IFN-γ)比例顯著升高,WG的自身抗原-胰蛋白酶3(PR3)刺激后,ANCA陽性患者外周血Th17的比例顯著升高,提示IL-17參與WG的病理損害,且與ANCA的產(chǎn)生相關(guān)[6],但具體機制不明?？紤]到WG的血管炎損傷主要由循環(huán)中大量的自身抗體PR3-ANCA介導,后者由B細胞分化的漿細胞產(chǎn)生。在其他自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡中,已證實IL-17與自身抗體-抗雙鏈DNA(dsDNA)抗體[7]和抗組蛋白抗體[8]的產(chǎn)生相關(guān)。因此WG患者體內(nèi)Th17產(chǎn)生的IL-17可能通過與其下游B細胞表面IL-17受體-IL-17R結(jié)合后誘導后者產(chǎn)生自身抗體-ANCA而發(fā)揮病理作用。至今IL-17R在WG患者體內(nèi)特別是淋巴細胞上的表達尚無相關(guān)研究。本實驗將通過檢測IL-17R在WG患者外周血免疫細胞包括中性粒細胞(PMN)、單核細胞(Mono)、總淋巴細胞(Lym),特別是B淋巴細胞和漿細胞上的表達有無異常,探索WG的病理機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

20例符合1990年美國風濕病學會(ACR)分類標準的WG患者,6例為非活動期患者,伯明翰血管炎活動性評分BVAS3[9]=0分。14例活動期患者,BVAS3均大于 0分,其中環(huán)磷酰胺(Cyc)治療組6例,甲氨喋呤(MTX)治療組8例。20例性別和年齡相匹配的正常人(HC)作為對照。

1.2 試劑

流式細胞儀所用熒光標記的小鼠抗人單抗如下:APC標記的抗IL-17R和同型對照IgG1,FITC標記的抗CD38、FITC標記的抗 CD20和同型對照IgG1,PE標記的抗CD19同型對照IgG1,以及紅細胞裂解液,均購自BD Pharmigen公司。

1.3 流式細胞儀檢測IL-17R表達

取5 mL EDTA抗凝的靜脈血,1 200轉(zhuǎn)/min室溫離心10 min,PBS洗滌3次。細胞沉淀以100 μ L PBS重懸,分別加入流式抗體APC-抗IL-17R+PE-抗FITC-抗CD38,APC-抗 IL-17R+PE-抗FITC-抗 CD20,同型對照APC-IgG1+PE-IgG1+FITCIgG1,4℃避光孵育30 min。1.5 mL紅細胞裂解液在4℃避光孵育10 min,1 200轉(zhuǎn)/min 4℃離心10 min,棄上清,細胞重懸于500 μ L流式緩沖液中。FACS Calibur(BD Bioscience)流式細胞儀檢測,CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 比較IL-17R在WG患者和正常人外周血免疫細胞上的表達

流式細胞儀檢測了IL-17R在WG患者(n=20)和正常人(n=20)外周血PMN、單核細胞、總淋巴細胞、B淋巴細胞漿細胞上的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),IL-17R在WG患者和正常人PMN、單核細胞、總淋巴細胞上的表達無顯著差異,但在WG患者B淋巴細胞(P<0.05)和漿細胞(P<0.05)上的表達顯著高于正常人。

2.2 比較IL-17R在活動期與非活動期WG患者外周血免疫細胞上的表達

根據(jù)BVAS3評分將WG患者分為活動期(n=14,BVAS3>0分)與非活動期(n=6,BVAS3=0分),流式細胞儀比較了IL-17R在2組患者外周血免疫細胞包括B淋巴細胞以及漿細胞上的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),活動期與非活動期WG患者中性粒細胞、單核細胞和總淋巴細胞表面 IL-17R的表達無差異,與非活動期患者相比,活動期患者IL-17R在B淋巴細胞及漿細胞上的表達有下降趨勢,但在統(tǒng)計學上無顯著差異。

2.3 比較IL-17R在CyC與MTX治療組WG患者外周血免疫細胞上的表達

流式細胞儀比較了IL-17R在Cyc(n=6)和MTX(n=8)治療組患者外周血中性粒細胞、單核細胞、總淋巴細胞、B淋巴細胞及漿細胞上的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),對于各種免疫細胞包括不同發(fā)育階段B細胞,IL-17R的表達在2個治療組間均無顯著性差異,見表1。

表1 IL-17R在各治療組WG患者外周血免疫細胞上的陽性率(%)

3 討 論

IL-17的生理功能主要是作為促炎因子發(fā)揮作用,例如刺激IL-6、一氧化氮和前列腺素E2(PGE2)的產(chǎn)生[10],還可協(xié)同其他炎癥因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α和IFN-γ[11]等加劇及放大局部炎癥反應,以及介導中性粒細胞和單核細胞趨化至炎癥部位[12]。研究發(fā)現(xiàn)IL-17參與很多自身免疫病[1-5],其作用機制不明,可能與其誘導自身抗體產(chǎn)生相關(guān)[7-8]。David等研究發(fā)現(xiàn),在腎小球腎炎模型鼠-BXD2中,IL-17可直接作用于生發(fā)中心的B細胞,促進其發(fā)育、遷移及分化為抗體產(chǎn)生細胞[13]。IL-17在韋格納肉芽腫病理機制中的參與作用尚屬初步探索階段。如前所述,WG患者體內(nèi)外周血中Th17及IL-17增多,自身抗體ANCA陽性的患者Th17升高更為明顯[6],故推測IL-17可能誘導漿細胞產(chǎn)生ANCA。因此,有必要檢測WG患者體內(nèi)不同發(fā)育階段的B淋巴細胞特別是漿細胞表面IL-17受體-IL-17R的表達是否存在異常。

作者實驗發(fā)現(xiàn),IL-17R在WG患者外周血B淋巴細胞及漿細胞表面的表達顯著高于正常人,提示與正常人相比,IL-17對WG患者B細胞發(fā)育的初始階段及分化為抗體產(chǎn)生細胞終末階段的作用均顯著增強,這與WG患者體內(nèi)增多的Th17比例及 IL-17濃度一致,即Th17通過產(chǎn)生IL-17與B細胞表面IL-17R相互作用,進一步啟動下游信號如抗體產(chǎn)生等參與WG發(fā)病。有趣的是,活動期WG患者B淋巴細胞及漿細胞表面IL-17R的表達并不高于非活動期患者,甚至有下降趨勢,原因尚不明確,可能的機制為活動期患者為控制病情,采用較強的免疫抑制劑聯(lián)合治療,甚至使用藥物的沖擊劑量,而緩解期患者多采用一種緩和的免疫抑制劑維持,免疫抑制劑的藥理作用可能抑制了B淋巴細胞表面 IL-17R的表達,這尚需進一步實驗確定。

因IL-17還可誘導中性粒細胞和單核細胞趨化至炎癥反應部位,作者還比較了IL-17R在WG患者和正常人群的這2種細胞表面的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論是WG患者和正常人之間,還是活動期與非活動期WG患者間,IL-17R在中性粒細胞和單核細胞的表達均無顯著差異,提示IL-17可能通過其他途徑參與WG的炎癥進展。

為探索不同治療藥物對IL-17R的影響,作者還檢測了WG常用的免疫抑制劑-環(huán)磷酰胺和甲氨蝶呤治療組外周血中性粒細胞、單核細胞和B淋巴細胞、漿細胞上IL-17R的表達。結(jié)果顯示,兩個治療組間無明顯差異,提示在這兩種免疫抑制劑的療效差異中,IL-17R的表達并非決定因素。

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