四川和河南烤煙葉片番茄紅素β環(huán)化酶基因的表達(dá)分析

賈 峰，魏慶華，劉衛(wèi)群,2

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，國(guó)家煙草栽培生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002)

類(lèi)胡蘿卜素（Carotenoids）是廣泛存在于自然界一類(lèi)重要天然色素的總稱(chēng)，主要由直鏈番茄紅素在一端或兩端環(huán)化后形成[1-2]。植物中起環(huán)化作用的酶主要有番茄紅素β環(huán)化酶（lycopene cyclase，Lycβ）和番茄紅素ε環(huán)化酶（Lyc-ε）2種。Lyc-β酶的主要功能是催化番茄紅素直鏈的一端或兩端，形成β環(huán)化，從而形成β玉米胡蘿卜素、γ胡蘿卜素和無(wú)所不在的β胡蘿卜素；Lyc-β和Lyc-ε酶共同催化形成常見(jiàn)的α胡蘿卜素；而Lyc-ε酶雖然可以單獨(dú)催化形成ε胡蘿卜素，但在植物體內(nèi)鮮見(jiàn)[3-4]。因此，Lyc-β酶是生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素的關(guān)鍵酶（基因）。

類(lèi)胡蘿卜素是烤煙煙葉主要致香成分的前體物[5-9]，與烤后煙葉中性致香成分含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系[10]。最近的研究表明，不同生態(tài)區(qū)煙草中類(lèi)胡蘿卜素含量差異很大[11]。將不同生態(tài)區(qū)烤煙煙葉中類(lèi)胡蘿卜素積累與Lyc-β基因轉(zhuǎn)錄水平直接聯(lián)系的報(bào)道很少。為此，筆者采用半定量RT-PCR并結(jié)合Northern雜交的方法研究了四川會(huì)理（清甜香型煙葉）與河南寶豐（濃香型煙葉）2個(gè)不同生態(tài)區(qū)現(xiàn)蕾期煙葉中Lyc-β基因表達(dá)的差異，旨在從分子水平揭示其含量差異的原因，為深入分析不同生態(tài)區(qū)煙葉類(lèi)胡蘿卜素的降解產(chǎn)物含量差異提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

取烤煙（Nicotiana tabacumL.）品種云煙85現(xiàn)蕾期上部煙葉為試驗(yàn)材料，分別于 2008—2009年在四川會(huì)理和河南寶豐進(jìn)行大田試驗(yàn)。

1.2 RNA提取、RT-PCR擴(kuò)增和Northern雜交

煙葉總RNA 的提取和cDNA第一鏈的合成以及半定量 RT-PCR體系參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行。煙草Lyc-β(GenBank 登錄號(hào)為 X81787.1)正向引物序列為：5' CAA GAA AGA ATG GTG GCT 3'，反向引物序列為：5' CAG GCG AGA TGA CAA GAA 3'（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為432 bp）；肌動(dòng)蛋白基因（Actin）(GenBank登錄號(hào)為 EU938079)的引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增參考文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行。以肌動(dòng)蛋白基因的相對(duì)含量作為內(nèi)參，按Actin擴(kuò)增后灰度分析的結(jié)果添加模板量。用UVBand紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)計(jì)算機(jī)軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度分析，以調(diào)整Lyc-β基因PCR 擴(kuò)增時(shí)的模板量。PCR擴(kuò)增條件同上，取等體積的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠（EB）染色后，采用 UVBand紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)計(jì)算機(jī)軟件對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。Northern雜交按照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行，探針是DIG DNA Labeling Kit（Roche）標(biāo)記的Lyc-β基因RT-PCR產(chǎn)物。

1.3 類(lèi)胡蘿卜素檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理

根據(jù)GB/T 5009.83—2003標(biāo)準(zhǔn)，分別取四川和河南烤煙上部煙葉的殺青烘干樣品，送云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院分析測(cè)試中心檢測(cè)類(lèi)胡蘿卜素含量，4次重復(fù)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Student’st檢驗(yàn)（P≤0.05和P≤0.01）分析。

2 結(jié) 果

2.1 RNA電泳

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)煙葉總RNA的結(jié)果(圖1)表明，28 S、18 S、5 S三條帶中28 S和18 S帶比較亮，說(shuō)明RNA樣品并未發(fā)生降解；A260/A280在1.90～2.00之間，說(shuō)明RNA樣品的純度高，可用于cDNA的合成。

圖1 煙葉總RNA的電泳檢測(cè)Fig.1 Total RNA separated on agarose gel

2.2 Lyc-β引物和內(nèi)參Actin引物RT-PCR結(jié)果

從圖2可以看出，Lyc-β基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶比較清晰，基本上沒(méi)有拖尾現(xiàn)象。兩地區(qū)煙葉的Actin擴(kuò)增產(chǎn)物基本一致，而四川煙葉中Lyc-β基因擴(kuò)增的條帶亮度大于河南的，說(shuō)明在現(xiàn)蕾期四川煙葉中Lyc-β基因表達(dá)水平高于河南的。

圖2 Lyc-β基因的半定量RT-PCR結(jié)果Fig.2 Semi-quantitative RT-PCR analysis of Lyc-β

2.3 Lyc-β基因表達(dá)的Northern雜交結(jié)果

Northern雜交結(jié)果(圖3)顯示，在兩個(gè)泳道RNA量一致的情況下，煙葉的雜交帶四川比河南的亮，表明四川煙葉中Lyc-β基因表達(dá)水平高于河南的。

圖3 Lyc-β表達(dá)的Northern雜交分析Fig.3 Northern blotting analysis of the Lyc-β expression

2.4 上部煙葉類(lèi)胡蘿卜素含量變化

通過(guò)檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)蕾期烤煙上部葉中葉黃素含量四川為（311.7±15.81）μg/g（DW），河南煙葉中的為（264.15±14.00）μg/g（DW）；四川和河南烤煙中β胡蘿卜素的含量分別為（104.93±4.62） μg/g（DW）和（69.53±3.40）μg/g（DW）；Student’st檢驗(yàn)結(jié)果表明，葉黃素和β-胡蘿卜素含量四川煙葉極顯著地（P≤0.01）高于河南的。這與基因Lyc-β的半定量RT-PCR和Northern雜交的結(jié)果相符。

3 討 論

煙草番茄紅素β環(huán)化酶的基因序列是 1996年由 Cunningham 等[7]首次克隆和鑒定出來(lái)的，隨后在番木瓜和馬鈴薯中鑒定出有2種Lyc-β基因，一種在光合組織中表達(dá)，而另一種在花和果實(shí)中特異表達(dá)[14-15]。本研究據(jù)Cunningham等在GenBank中發(fā)表的煙草中類(lèi)胡蘿卜素合成的關(guān)鍵酶Lyc-β基因的序列設(shè)計(jì)引物，用半定量RT-PCR和Northern雜交技術(shù)分析了四川和河南烤煙現(xiàn)蕾期Lyc-β基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，四川煙葉現(xiàn)蕾期Lyc-β基因表達(dá)水平明顯高于河南（圖2和圖3）；四川同期的殺青樣品檢測(cè)表明類(lèi)胡蘿卜素（包括葉黃素和β-胡蘿卜素）含量也明顯高于河南（圖4）。這表明煙葉類(lèi)胡蘿卜素含量和番茄紅素β環(huán)化酶基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)是一致的。由此Lyc-β基因可以作為類(lèi)胡蘿卜素含量預(yù)測(cè)的分子指標(biāo)，通過(guò)測(cè)定烤煙生長(zhǎng)期Lyc-β基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)預(yù)測(cè)煙葉成熟期類(lèi)胡蘿卜素含量。

2000年，Ye等[16]把Lyc-β基因?qū)胨?，能夠使本?lái)不含類(lèi)胡蘿卜素的水稻胚乳中合成了4種類(lèi)胡蘿卜素。而Dharmapuri等[17]在2002年通過(guò)基因工程手段把Lyc-β基因轉(zhuǎn)入番茄，使番茄果實(shí)中的類(lèi)胡蘿卜素增加近 10倍，表明Lyc-β基因的表達(dá)升高可以顯著提高類(lèi)胡蘿卜素的生物合成。因此，可以通過(guò)基因工程的手段來(lái)提高煙葉中類(lèi)胡蘿卜素的含量，并且豐富煙草種質(zhì)資源。

一般認(rèn)為類(lèi)胡蘿卜素的合成與溫度、光照和濕度等有關(guān)，這些環(huán)境因子對(duì)植物體內(nèi)類(lèi)胡蘿卜素合成基因的表達(dá)有明顯影響[18]，然而環(huán)境因子包括了溫度、光照、濕度、空氣、土壤等因子，其中是什么因子對(duì)Lyc-β基因的表達(dá)影響較大？是通過(guò)何種途徑影響的？需要進(jìn)一步深入研究，才能夠更加準(zhǔn)確地實(shí)現(xiàn)通過(guò)對(duì)環(huán)境因子的調(diào)控，達(dá)到調(diào)控類(lèi)胡蘿卜素合成的過(guò)程。

4 小 結(jié)

通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增和Northern雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)四川和河南煙葉中Lyc-β基因表達(dá)量的結(jié)果基本一致，在現(xiàn)蕾期四川煙葉中Lyc-β基因表達(dá)水平明顯高于河南煙葉的。在現(xiàn)蕾期四川烤煙上部葉中葉黃素的含量顯著高于河南的。這與基因Lyc-β的半定量RT-PCR和Northern雜交的結(jié)果相互統(tǒng)一。因此，四川和河南兩個(gè)生態(tài)區(qū)煙葉中類(lèi)胡蘿卜素含量的差異可能與Lyc-β基因的表達(dá)差異有關(guān)，為進(jìn)一步深入揭示不同生態(tài)對(duì)烤煙香氣風(fēng)格的形成具有一定的理論意義。

[1]楊式華，徐濟(jì)倉(cāng)，盛冀萍，等.煙草中質(zhì)體色素研究進(jìn)展[J].云南化工，2007，34（1）：69-73.

[2]儲(chǔ)大燕.煙草中類(lèi)胡蘿卜素及其異構(gòu)體的分析研究[M]//分析化學(xué)，合肥：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2009：75.

[3]Park H,Kreunen S,Cuttriss A,et al.Identification of the carotenoid isomerase provides insight into carotenoid biosynthesis,prolamellar body formation,and photomorphogenesis[J].Plant Cell,2002,14(2):321-332.

[4]Isaacson T,Ronen G,Zamir D,et al.Cloning of tangerine from tomato reveals a carotenoid isomerase essential for the production of beta-carotene and xanthophylls in plants[J].Plant Cell,2002,14(2):333-342.

[5]韋鳳杰，劉國(guó)順，楊永鋒，等.烤煙成熟過(guò)程中類(lèi)胡蘿卜素變化與其降解香氣物質(zhì)關(guān)系[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38（9）：1882-1889.

[6]王能如，李章海，王東勝，等.我國(guó)烤煙主體香味成分研究初報(bào)[J].中國(guó)煙草科學(xué)，2009，30（3）：1-6.

[7]Cunningham J,Pogson B,Sun Z,et al.Functional analysis of the beta and epsilon lycopene cyclase enzymes of Arabidopsis reveals a mechanism for control of cyclic carotenoid formation[J].Plant Cell,1996,8(9)：1613-1626.

[8]王瑞新.煙草化學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[9]楊虹琦，周冀衡，羅澤民，等.不同產(chǎn)區(qū)烤煙中質(zhì)體色素及降解產(chǎn)物的研究[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，26（5）：64-68.

[10]葉協(xié)鋒，李正，劉旭鋒，等.烤煙巨豆三烯酮含量與中性香氣成分含量關(guān)系分析[J].土壤通報(bào)，2009，40（5）：1167-1170.

[11]周冀衡，楊虹琦，林桂華，等.不同烤煙產(chǎn)區(qū)煙葉中主要揮發(fā)性香氣物質(zhì)的研究[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2004，30（1）：20-23.

[12]戚元成，馬雷，王菲菲，等.煙草打頂對(duì)腐胺 N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的影響[J].植物生理學(xué)通訊，2009，45（7）：684-686.

[13]戚元成，張世敏，王麗萍，等.谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因過(guò)量表達(dá)能加速鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長(zhǎng)[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2004，30（5）：517-522.

[14]Devitt L,Fanning K,Dietzgen R,et al.Isolation and functional characterization of a lycopene β-cyclase gene that controls fruit colour of papaya (Carica papayaL.)[J].J Exp Bot.,2010,61(1):33-39.

[15]Skelton R,Yu Q,Srinivasan R,et al.Tissue differential expression of lycopene β-cyclase gene in papaya[J].Cell research,2006,16(8):731-739.

[16]Ye X,Al-Babili S,Kloti A,et al.Engineering the provitamin A (β-carotene) biosynthetic pathway into(carotenoid-free) rice endosperm[J].Science,2000,287(1):303-305.

[17]Dharmapuri S,Rosati C,Pallara P,et al.Metabolic engineering of xanthophyll content in tomato fruits[J].FEBS Lett,2002,519(1):30-34.

[18]朱長(zhǎng)甫，陳星，王英典.植物類(lèi)胡蘿卜素生物合成及其相關(guān)基因在基因工程中的應(yīng)用[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，2004，30（6）：609-618.