地膚子中總黃酮提取工藝及其抗氧化性研究

張競怡，王文杰，史 歡，盧小龍，郭豫梅

(陜西理工學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西 漢中 723001)

地膚(Kochia scoparia)，俗名掃帚菜、掃帚苗，屬藜科(Chenopodiaceae)一年生草本植物。地膚子為其成熟干燥的果實(shí)，其性寒、味甘苦、無毒［1］。地膚子的營養(yǎng)成分非常豐富，含有三萜皂甙、齊墩果酸及油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸［2］，同時(shí)它還有很高的藥用價(jià)值，具有利小便、清濕熱、止癢之功效。外用可治各種皮膚瘙癢、濕疹、干癬、皮膚過敏等?，F(xiàn)代研究表明，地膚子主要含三萜皂苷、生物堿、黃酮類和脂肪油等成分，具有降血糖，抗病毒，增強(qiáng)免疫力等功效［3－4］。隨著人們對(duì)地膚子營養(yǎng)成分和藥用價(jià)值認(rèn)識(shí)的逐步深入，地膚子越來越受到人們的重視，成為眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)。

目前，對(duì)地膚子中皂苷、生物堿、脂肪酸等生物活性成分研究報(bào)道的較多，而對(duì)地膚子中黃酮類物質(zhì)研究報(bào)道的較少。黃酮類化合物具有抑菌消炎、抗氧化、抗衰老、抗癌防癌等諸多功效［5］。在植物器官中提取總黃酮已有不少報(bào)道［6－8］，研究地膚子黃酮類物質(zhì)的提取工藝及抗氧化性，旨在為大量提取、開發(fā)黃酮類化合物及綜合利用地膚子資源提供依據(jù)，同時(shí)對(duì)從植物原料中提取天然抗氧化劑的研究開發(fā)具有一定的指導(dǎo)作用。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

地膚子購于漢中健康大藥房。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn)(生化試劑)。無水乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、水楊酸試劑以上均為國產(chǎn)分析純。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司)、AL204-IC型電子天平(上海志榮電子科技有限公司)、722E型分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)、800型離心沉淀器(上海手術(shù)器械廠)、SHB-III型臺(tái)式循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)和索式提取器(金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1 樣品處理

將地膚子在50℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎、石油醚脫脂，風(fēng)干，得到樣品粉末。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精確稱取經(jīng)60℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用60%乙醇溶解定容至50 mL的容量瓶中，配制成0.2 mg·mL－1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取0.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00，7.00，8.00，9.00 mL，分別置于25 mL的容量瓶中，各加30%乙醇溶液至8 mL，再加5%NaNO2溶液0.4 mL，振搖后放置6 min;加10%Al(NO3)3溶液0.4 mL，搖勻后放置6 min;加4%NaOH溶液8 mL，用30%乙醇定容至刻度，放置10 min后，以相應(yīng)的溶劑做空白，在波長508 nm下測(cè)其吸光度［9］。以濃度(X，mg·mL－1)為橫坐標(biāo)，以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁濃度－吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總黃酮含量測(cè)定。取2 mL提取液，按照1.2.2的NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系絡(luò)合化學(xué)吸光法測(cè)定樣品溶液的吸光度［10］。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出總黃酮的濃度，計(jì)算總黃酮的提取率。計(jì)算公式為:總黃酮提取率/%=總黃酮濃度(mg·mL－1) ×稀釋倍數(shù)×提取液體積(mL) ×10－3/樣品質(zhì)量 ×100。

1.2.3 地膚子總黃酮提取

單因素試驗(yàn)。精確稱取地膚子粉末樣品1.000 0 g于150 mL錐形瓶中，按試驗(yàn)要求加入一定量的提取溶劑，在一定的溫度下浸提一定時(shí)間。抽濾、離心，取樣測(cè)定，試驗(yàn)乙醇濃度、料液比、溫度、提取時(shí)間等因素對(duì)地膚子總黃酮提取的影響。

正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、溫度(C)、料液比(D)為試驗(yàn)因素，以地膚子總黃酮的提取率為試驗(yàn)指標(biāo)，選用L9(34)正交表確定最佳的提取工藝。1－3水平A分別為60%，70%和80%，B分別為2.0，2.5和3.2 h，C分別為60，70和80℃，D 分別為 1∶70，1∶80 和 1∶90。

1.2.4 地膚子黃酮對(duì)羥自由基的清除能力的測(cè)定

利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生羥自由基(-OH)，由于-OH具有很高的反應(yīng)活性，存活時(shí)間短，若在該反應(yīng)體系中加入水楊酸就能有效地捕捉-OH，并產(chǎn)生有色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在波長508 nm處有強(qiáng)吸收。若在該反應(yīng)體系中加入具有清除-OH功能的被測(cè)物，則會(huì)與水楊酸競爭-OH，從而使有色產(chǎn)物生成量減少［11］。在試管中依次移取 l mmol·L－1硫酸亞鐵2.5 mL和3 mmol·L－1雙氧水2.5 mL，混合均勻后加入3 mmol·L－1水楊酸7.5 mL，在37℃的恒溫水中反應(yīng)15 min，在722E型分光光度計(jì)上于508 nm波長處測(cè)其吸光度，即為Y0值。再加入1 mL不同濃度的樣品提取液，搖勻，于37℃水浴中反應(yīng)15 min，測(cè)得其吸光度(Yx)，用下列公式計(jì)算其清除率。清除率/%=(Y0－Yx)/Y0×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.2節(jié)所設(shè)計(jì)蘆丁濃度梯度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，結(jié)果見圖1。得到蘆丁濃度X與吸光度Y的回歸方程式為:Y=10.418X+0.002 8，R2=0.999 7，表明蘆丁濃度在這一范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度

圖1 地膚子總黃酮含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g地膚子粉末，在料液比1∶60、溫度60℃、提取時(shí)間2 h的條件下，用不同濃度的乙醇對(duì)地膚子進(jìn)行浸提，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響

由圖2可以看出，黃酮的提取率開始隨乙醇濃度的增大而增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)提取率達(dá)到最大，以后再增加，黃酮提取率有所下降?？赡苁怯捎陔S著乙醇濃度的增大導(dǎo)致溶液的極性不同，一些脂溶性雜質(zhì)的濃度增加，影響黃酮類物質(zhì)的溶出［9］。故進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)乙醇濃度最好選 70%左右。

2.2.2 料液比

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g地膚子粉末，在乙醇濃度70%、溫度60℃、提取時(shí)間2 h的條件下，用不同料液比對(duì)地膚子進(jìn)行浸提，結(jié)果見圖3。

由圖3可以看出，黃酮提取率隨料液比增大而增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶80時(shí)黃酮提取率最大，以后變化不大。說明黃酮已經(jīng)基本全部溶出，再增加料液比黃酮提取率不會(huì)明顯的增加。因此，料液比選為1∶80為宜。

2.2.3 提取時(shí)間

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g地膚子粉末，在乙醇濃度70%、料液比1∶80、溫度60℃的條件下，用不同時(shí)間對(duì)地膚子進(jìn)行浸提，結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

從圖4可以看出，提取時(shí)間在2.5 h左右效果最好，此時(shí)黃酮類物質(zhì)溶出已達(dá)到平衡，再延長時(shí)間，由于部分乙醇揮發(fā)而導(dǎo)致沸點(diǎn)逐漸增大，破壞了一些黃酮化合物，從而使總黃酮的提取率有所下降。

2.2.4 溫度

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g地膚子粉末，在乙醇濃度70%、料液比1∶80、提取時(shí)間2.5 h的條件下，用不同溫度對(duì)地膚子進(jìn)行浸提，結(jié)果見圖5。

圖5 溫度對(duì)總黃酮提取率的影響

從圖5可以看出，40～70℃，黃酮提取率隨著溫度的升高迅速增大，這是由于溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，滲透、擴(kuò)散、溶解速率加快，黃酮化合物更易從細(xì)胞中溶出［12］。當(dāng)溫度超過70℃以后，黃酮的提取率開始下降?？赡苁菧囟冗^高，黃酮化合物被破壞導(dǎo)致其提取率下降。故地膚子黃酮提取時(shí)溫度最好控制在70℃左右。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

地膚子提取總黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1可知，各因素對(duì)地膚子總黃酮提取率大小的影響次序?yàn)?乙醇濃度＞溫度＞料液比＞提取時(shí)間。同時(shí)還可以看出地膚子中總黃酮提取的最佳工藝為A3C3D2B3，即用80%乙醇為提取劑，在80℃條件下以料液比1∶80提取3 h。

表1 地膚子提取總黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果

地膚子黃酮對(duì)羥自由基的清除能力見表2。

由表2可以看出，地膚子黃酮對(duì)羥自由基有明顯的清除作用，隨著地膚子黃酮濃度的增加清除作用加強(qiáng)。

表2 地膚子黃酮對(duì)羥自由基的清除能力

3 小結(jié)與討論

通過單因素梯度試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得到從地膚子中提取總黃酮的最佳提取條件組合為乙醇濃度80%、提取溫度80℃、料液比1∶80、提取時(shí)間3 h。

地膚子總黃酮有較好的羥自由基清除能力。由此可見地膚子黃酮是一種很好的天然抗氧化劑，具有較高的藥用價(jià)值，值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

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