利用噬菌體肽庫序貫篩選組織因子靶向肽*

梁綺雯，饒本強，許 希，肖 剛，汪建平

(中山大學附屬第六醫(yī)院1檢驗科，2結(jié)直腸外科，廣東 廣州 510655;3廣州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，廣東 廣州 510120)

噬菌體展示技術(shù)自1985年Smith［1］利用基因工程手段所建立以來，已經(jīng)在抗原表位篩選、免疫學診斷、疫苗研制、藥物篩選、分子生物學等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，更是目前腫瘤靶向治療靶標篩選的最常用方法。但是，對于篩選跨膜受體靶向肽，該法尚不理想。3種常規(guī)的噬菌體淘洗方法:(1)用人工合成純化胞膜外段蛋白的淘選;(2)用完整的腫瘤細胞的差減淘選;(3)動物體內(nèi)篩選實驗［2］，均存在較多影響因素，如單一方法產(chǎn)生的非特異富集、細胞易脫落、合成蛋白變異、體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境等。本研究將純化受體淘選和腫瘤細胞淘選相結(jié)合，采用序貫篩選(受體－細胞序貫篩選法，screen for targeting receptor and cell alternately with phage display，STRCA法)這一特殊篩選方法篩選跨膜受體組織因子(tissue factor，TF)的靶向肽，為臨床實踐提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 試劑與細胞株

Ph.D.TM噬菌體隨機 7 肽庫(Ph.D.TM－7 Phage Display Peptide Library Kit)、測序引物 －96gШ(5'－HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG－3')和 E.coli ER2738宿主菌均購自 New England Biolabs(Lot:0121004);TF購自Calbiochem(Lot:D00063981);HT－29細胞株由本室保存;抗TF抗體購于R＆D(Lot:AF2339);辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記抗噬菌體M13單抗購自GE;HRP－馬抗羊Ⅱ抗購于北京鼎國公司;驢抗鼠－Cy3多抗購自ProteinTech Group(Lot:SA00009－3)。

2 方法

2.1 細胞的培養(yǎng) HT－29細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素雙抗、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI－1640培養(yǎng)基中。細胞于37℃、5%CO2孵箱中靜置培養(yǎng)，每隔3～4 d進行傳代，培養(yǎng)3代后取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2 免疫熒光法檢測HT－29細胞TF受體表達 HT－29細胞接種在96孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，待細胞呈貼壁狀態(tài)，孔內(nèi)細胞覆蓋率達95% ～98%時，4%多聚甲醛固定;含1%Triton X－100的PBS洗3次后，用1%胎牛血清封閉;加入1∶40稀釋的抗TF單抗，置于濕盒4℃過夜;除去Ⅰ抗，加入1∶40稀釋的驢抗鼠Cy3多抗，室溫避光孵育1 h，同時設(shè)立對照;除去Ⅱ抗，于熒光顯微鏡下觀察，陽性細胞呈現(xiàn)紅色熒光。

2.3 噬菌體肽庫序貫淘洗 實驗采用純化受體與完整細胞交替進行5輪篩選。第1輪純化受體淘洗:將TF(5 μg)過夜包被至聚苯乙烯培養(yǎng)皿 NUNC中，封閉劑作用2 h后，用0.05%TBST洗滌6次，加入1 mL PBS稀釋的10 μL噬菌體展示7肽庫(滴度為2.0×1011)，室溫30 r/min作用2 h，0.05%TBST洗滌 10次;150 μL 0.2 mol/L Gly－HCl(pH 2.2)30 r/min作用10 min后，用1 mol/L Tris·HCl(pH 9.1)中和液15 μL中和并收集洗脫液，此為經(jīng)第1輪體外篩選所得噬菌體。洗脫液經(jīng)滴度測定、擴增后用于下一輪細胞篩選。第2輪細胞淘選:將HT－29接種NUNC板中，待72 h細胞基本長滿后，1%PBSM靜置封閉20 min，0.05%TBST洗滌2次，加入1 mL PBS稀釋的10 μL上一輪擴增產(chǎn)物(滴度為2.0×1011)，室溫30 r/min作用1 h，0.1%TBST洗滌5次;150 μL 0.2 mol/L Gly－HCl(pH 2.2)30 r/min作用10 min后，用1 mol/L Tris·HCl(pH 9.1)15 μL中和并收集洗脫液，此為經(jīng)第2輪體外篩選所得噬菌體。第3、5輪篩選均以純化TF為靶標，第4輪篩選以HT－29為靶標。第4輪細胞篩選中，加入噬菌體作用時間遞減至0.5 h，洗滌液濃度提高到0.3%TBST，洗滌時間增加到2 min/10次，其余步驟如第2輪。第3輪和第5輪淘洗中 TF包被量逐次遞減2.5 μg、1.25 μg，加入噬菌體作用時間逐次遞減1 h、0.5 h，洗滌液濃度也逐步提高至0.1%TBST、0.5%TBST，其余步驟如第1輪。在第5輪中加入Gly－HCl(pH 2.2)后棄去，再重復(fù)加入 150 μL 0.2 mol/L Gly－HCl(pH 2.2)30 r/min作用10 min，用 1 mol/L Tris·HCl(pH 9.1)中和液15 μL中和并收集第2次洗脫液，測量第2次洗脫液的滴度。

2.4 高滴度單克隆噬菌體的制備 從小于100個噬菌體藍斑的LB/IPTG/X－gal平板培養(yǎng)板中挑選30個界限分明、生長良好的藍斑，將其分別接種于1 mL過夜ER2738的1∶100稀釋物中，37℃ 250 r/min擴增4.5 h。經(jīng)2次4℃、12000×g離心10 min后，保存80%上清液即可。

2.5 ELISA檢測噬菌體陽性克隆 將HT－29接種96孔板中，待細胞長滿單層后，4%多聚甲醛固定;2%PBSM室溫靜置封閉1 h;0.05%PBST洗3次后分別加入109pfu稀釋單克隆噬菌體室溫30 r/min孵育1 h;用PBS作陰性對照;0.05%PBST洗3次后加入HRP－抗M13單抗，室溫30 r/min孵育1 h;TMB避光顯色20 min，加入終止液。于450/630 nm雙波長測定其A值。

2.6 測序模板快速純化 按照Ph.D.TM噬菌體隨機7肽庫說明書抽提單克隆噬菌體DNA，并將30個模板溶液送Invitrogen公司測序。

2.7 多肽合成 30個模板測序結(jié)果重復(fù)率高的4個序列進行多肽合成，分別命名為A、B、C、D肽，E肽是A、B肽通過連接肽(Gly3Ser)4所合成，多肽純度均大于95%。

2.8 競爭抑制ELISA檢測合成多肽親和力 將HT－29接種96孔板中，待72 h細胞基本長滿后;4%多聚甲醛固定;2%PBSM室溫靜置封閉1 h;0.05%PBST洗3次;分別加入多肽A、B、C、D、E 系統(tǒng)稀釋(0、0.00002、0.0002、0.02、0.2、2 mmol/L)，與細胞室溫30 r/min離心孵育1 h;用PBS作陰性對照;0.05%PBST洗3次;加入羊抗TF抗體，室溫30 r/min離心孵育1 h;0.05%PBST洗3次，加入馬抗羊IgG抗體，室溫30 r/min離心孵育1 h;0.05%PBST洗3次，TMB避光顯色20 min，加入終止液。于450/630 nm雙波長測定其A值。

2.9 重復(fù)實驗 實驗嚴格按照建立的方法重復(fù)進行第2次的5輪序貫篩選，所用試劑均是與上述實驗為同一廠家、同一批號的試劑，實驗環(huán)境、操作人員均保持不變。

結(jié) 果

1 HT－29細胞異常高表達TF

免疫熒光法檢測HT－29細胞膜TF表達情況，由圖1可見絕大多數(shù)HT－29細胞膜呈現(xiàn)強紅色熒光，表明有TF異常高表達。而陰性對照則基本不發(fā)出熒光信號。

Figure 1.Immunofluorescent staining of HT－29 colon cancer cells(×200).Strong TF expression was found in HT－29 colon cancer cells(A)but negative in the control(B).圖1 HT－29細胞免疫熒光染色結(jié)果

2 生物篩選

每輪回收率如表1所示，第1、3、5輪篩選中回收率明顯呈階梯狀上升，第2、4輪細胞篩選回收率也有輕微上升，細胞篩選富集較慢。總體回收率由(2.25×10－4)%增加到(1.32×10－2)%，可見通過5輪淘選對噬菌體隨機7肽庫進行選擇性的富集，富集度達58.6倍。

表1 噬菌體7肽庫5輪篩選的選擇性富集效應(yīng)Table 1.Selective enrichment of phage heptapeptide library through 5 rounds of panning

3 陽性噬菌體克隆對HT－29結(jié)合活性鑒定

直接法ELISA初步鑒定30個克隆與HT－29結(jié)合活性，見圖2。以A值高出陰性對照(A值為0.064)3倍以上為陽性，陽性率為76.7%。初步確定篩選的噬菌體克隆能與TF特異性結(jié)合。

Figure 2.The affinity of the phage clones to HT －29 cells.圖2 ELISA檢測噬菌體克隆與HT－29細胞的親和力

4 序列分析

30個噬菌體克隆DNA測序結(jié)果中，4種肽(分別命名為A、B、C、D 肽)的總重復(fù)率高達83.3%，其中 A 肽重復(fù)率為23.3%(7/30)，B 肽為 23.3%(7/30)，C 肽為 26.7%(8/30)，D肽為10%(3/30)，表明經(jīng)過5輪篩選，取得較高的特異性和富集效果。經(jīng)搜索BLAST數(shù)據(jù)庫，均未發(fā)現(xiàn)與以上4個多肽具有良好同源性有意義的蛋白序列，表明我們篩選到一種的新的TF靶向肽。

5 競爭抑制ELISA檢測合成多肽親和力

合成多肽A、B、C、D、E與抗TF抗體競爭結(jié)合HT－29細胞，在450/630 nm雙波長下分別測定其A值。5種肽IC50分別為 3.25 nmol/L、6.72 mol/L、3.24 × 103mol/L、2.08 × 102mol/L和45.77 mol/L。A值越低，說明人工合成多肽與 TF的親和力越高，其中以多肽A親和力最高，并且呈劑量依賴性。E肽親和性不如單一的A、B肽。5種合成肽ELISA競爭抑制曲線見圖3。

Figure 3.The competitive inhibitory effect of five synthetic peptides(A，B，C，D，E)on the binding of HT －29 cells.圖3 5種合成肽的競爭抑制曲線

6 實驗可重復(fù)性

實驗按照我們建立的方法重復(fù)進行第2次的5輪序貫篩選，獲得的陽性噬菌體克隆序列與第1次實驗所獲得的相比，重復(fù)率為33.3%，其中包括在第1次篩選中有高親和性的A肽。

討 論

目前篩選跨膜受體靶向肽尚未有理想的噬菌體展示方法。普遍采用以合成的胞外區(qū)多肽為靶標的篩選方法［3］，但獲得的結(jié)果存在局限性，原因是:(1)體外人工合成胞外段短肽盡管一級結(jié)構(gòu)上與天然多肽保持一致，但是由于缺乏跨膜段和細胞內(nèi)段，其僅能模擬多肽的線性表位，無法呈現(xiàn)構(gòu)象性表位信息，可能導(dǎo)致變異;(2)而且合成胞膜外段工藝復(fù)雜，驗證過程繁瑣;(3)篩選結(jié)果偶然性較大，重復(fù)率低。

有鑒于此，本實驗建立的篩選特定跨膜受體胞膜外段靶向片段的噬菌體方法具有3個特點:(1)本文不采用人工合成TF胞外段為靶標的方法進行篩選，而直接采用純化TF受體為靶標，目的是盡可能保持TF天然構(gòu)象和生物活性，減少變異帶來的假陽性結(jié)果;(2)HT－29細胞上異常表達大量TF受體。利用HT－29為靶標，與純化TF受體進行序貫篩選，既可以避免篩選出來的噬菌體與HT－29細胞表面其它受體非特異性結(jié)合，也可避免與純化TF的跨膜區(qū)或細胞內(nèi)區(qū)結(jié)合;(3)實驗中并沒有出現(xiàn)野生型噬菌體的偏嗜性現(xiàn)象，陽性噬菌體克隆亦具有較高的再現(xiàn)率。

本研究對于實驗條件采取嚴格的控制:在第1輪淘洗中，為了保證篩選出來的噬菌體種類足夠多，特別是低親和、高特異性克隆能同樣得到擴增，先采用擴增效率較高的以TF為靶標的篩選方法，同時采用嚴謹度較低的篩選強度。噬菌體展示技術(shù)使用單一方法進行篩選時不可避免存在非特異性吸附，非特異噬菌體在篩選過程中同樣被吸附、洗脫、擴增而被保留下來［4］。因此在第2輪中我們換用了以HT－29為靶標的方法，雖然富集效率有所降低，但是有效地去除上一輪中因非特異吸附而富集的噬菌體。整個淘選過程在以純化受體與完整細胞交替為靶標序貫進行。實驗選擇適當嚴謹度的篩選條件［5］，包括采取遞減包被受體的濃度，遞增洗滌液濃度，延長洗脫時間和增加洗脫次數(shù)的方法，并收集最后一輪淘選的第2洗脫液等方法，以期獲得高特異性和高親和性的噬菌體。

我們篩選的結(jié)果，4種肽序列的總重復(fù)率高達83.3%，重復(fù)進行第2次實驗，出現(xiàn)相同陽性噬菌體序列為33.3%，表明優(yōu)勢序列得到富集，且具有可重復(fù)性［6］。為了排除噬菌體克隆表面其它蛋白受體與目的靶蛋白結(jié)合假陽性的可能，本文利用競爭抑制ELISA檢測比較各合成肽的TF親和力，其中A肽IC50為3.25 nmol/L，出現(xiàn)頻率亦較高，疏水性高且?guī)д姾?，是理想的針對腫瘤細胞特異表達TF的靶向肽。

實驗中根據(jù)篩選結(jié)果選擇重復(fù)率高的A、B肽，通過連接肽(Gly3Ser)4構(gòu)建成復(fù)合肽E，期望所構(gòu)建的復(fù)合肽發(fā)揮更強大的特異靶向作用，但通過競爭抑制 ELISA未證明其優(yōu)越性，反而其親和性不如單一的A、B肽，原因可能為:(1)親和性高的A、B肽之間存在相互競爭，限制復(fù)合肽E結(jié)合力;(2)A、B肽之間的連接肽無法將A、B肽充分隔離，空間位阻使復(fù)合肽E結(jié)合力下降。

TF是能與因子VII/VIIa結(jié)合而啟動外源性凝血級聯(lián)反應(yīng)的跨膜糖蛋白，且能作為細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的一員與蛋白酶激活受體(protease－activated receptors，PARs)結(jié)合啟動細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與腫瘤細胞生長、侵潤、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管形成的過程，可能成為一個新型的腫瘤標志物［7－8］?；赥F的臨床應(yīng)用價值，本實驗以TF為研究對象，對噬菌體隨機7肽庫進行5輪序貫淘洗，成功篩選A肽，憑借其分子量小、與TF高特異親和性、合成和純化簡便，在臨床應(yīng)用勢必有廣闊的前景，本文擬在本實驗基礎(chǔ)上，進一步通過動物實驗來鑒定多肽特異性、免疫原性等，為今后應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

固相噬菌體展示技術(shù)對篩選暫無法完全了解結(jié)構(gòu)與功能的靶蛋白的高親和配體有其無可比擬的優(yōu)越性，但這種方法是針對特定的受體一種盲篩的方法，存在偶然性，肽庫的多樣性也在一定程度被噬菌體轉(zhuǎn)染宿主菌的效率所限制，而且多輪篩選使野生型噬菌體擴增而產(chǎn)生假陽性。本研究創(chuàng)新性將純化受體和完整細胞進行序貫淘洗，獲得獨特與TF胞外段結(jié)合的噬菌體克隆，而且并未出現(xiàn)野生型噬菌體偏嗜性，陽性克隆再現(xiàn)性高。作為一種優(yōu)化方法，STRCA法噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于篩選跨膜受體靶向肽具有現(xiàn)實意義。

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