葛根素對腎性高血壓大鼠apelin－12、AngⅡ及NO含量與血壓的影響*

黃幀檜，張 培，楊 帆，丁伯平

(皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，中藥藥理國家三級實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241002)

高血壓是最常見的心血管疾病，會引起嚴(yán)重的心、腦、腎并發(fā)癥，威脅人類健康。因此，對于高血壓及其并發(fā)癥治療的研究有著重大意義。在腎性高血壓的發(fā)生機(jī)制中，最重要的是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)被異常激活。RAS可調(diào)節(jié)水鈉平衡、血管收縮張力，對腎性高血壓的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。而在RAS中關(guān)鍵因子無疑是血管緊張素Ⅱ(angiotensin II，AngⅡ)。

1998年日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了一種新的調(diào)節(jié)肽apelin。Apelin的前體由77個氨基酸組成，在體內(nèi)可生成長度不等的多肽片段，常見的有apelin-12、apelin-13、apelin-36。Apelin具有降低血壓、調(diào)節(jié)心臟和舒張血管的功能［1-3］。Apelin與其受體APJ組成系統(tǒng)，該系統(tǒng)與血管緊張素Ⅱ-血管緊張素Ⅱ1型受體(AngⅡ-AT1)系統(tǒng)失衡可能是高血壓發(fā)生發(fā)展的重要因素［4］。

葛根素來源于豆科植物葛的根，臨床上用于治療冠心病、高血壓等疾?。?］。本實(shí)驗(yàn)室曾觀察葛根素對腎性高血壓大鼠腎臟AngⅡ含量的影響［6］，初步探討過葛根素的降壓機(jī)制。但有研究發(fā)現(xiàn)，apelin-36在腎性高血壓的發(fā)生過程中起著重要作用［7-8］。另有研究發(fā)現(xiàn)，apelin-12 比 apelin-36的降壓作用更明顯［9］。本研究以葛根素為腎性高血壓大鼠的治療藥物，觀察其對高血壓發(fā)病的一系列相關(guān)因素——apelin-12、Ang II和一氧化氮(nitric oxide，NO)水平的影響，初步探討其可能的降壓機(jī)制。

材料和方法

1 動物

SD大鼠65只，雄性，體重180～220 g。購自南京青龍山實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK(浙)2008-0033。分籠飼養(yǎng)，每籠1只，保持溫度22℃ ～24℃，濕度60% ～65%，自由進(jìn)食飲水。

2 藥物

葛根素注射液，山東方明藥業(yè)股份有限公司，批號為H20033292;卡托普利，上海普康藥業(yè)有限公司，批號為H31021327。

3 試劑

AngⅡ放射免疫試劑盒，北京北方生物技術(shù)研究所，批號為20100820;NO試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號為20100919;大鼠apelin-12 ELISA檢測試劑盒，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號為20110301B。

4 儀器

ALC-NIBP無創(chuàng)尾動脈血壓心率測定系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司);勻漿儀(PRO250);高速低溫離心機(jī)22R(Beckman Coulter);HH.S型電熱恒溫水浴鍋(江蘇省醫(yī)療器械廠);GC21500型γ放射免疫計數(shù)器(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);U-2800分光光度計(日立公司);ELx800酶標(biāo)儀(BioTek)。

5 主要方法

雄性SD大鼠65只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)抽取8只作為假手術(shù)組，其余57只采用兩腎一夾法造成腎性高血壓大鼠模型。以25%烏拉坦(4 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，分離左腎動脈、放置內(nèi)徑為0.2 mm的銀夾并打結(jié)固定。假手術(shù)組操作方法同上，但不放置銀夾。術(shù)后3 d連續(xù)給予青霉素4×105U肌注預(yù)防感染。尾袖法測定清醒大鼠術(shù)前、術(shù)后及用藥后動脈壓，術(shù)后4周收縮壓≥160 mmHg者為造模成功［10］，入選腎性高血壓大鼠(renal hypertensive rat，RHR)組。將手術(shù)成功的42只大鼠隨機(jī)分成5 組:高(n=9)、中(n=8)、低(n=8)劑量葛根素組分別以及卡托普利組(n=9)、模型組(n=8)。術(shù)后第5周開始給藥，高、中、低劑量葛根素組分別以葛根素100 mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg腹腔注射;卡托普利組以卡托普利(30 mg/kg)灌胃;假手術(shù)組與模型組以等量生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥6周，每2周測1次血壓。給藥6周后，在25%烏拉坦麻醉下腹主動脈取血，離心后取上清液待測apelin、Ang II和NO含量。取出右側(cè)腎臟，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗后濾紙吸干，將右腎的一半置入10%中性甲醛中固定;右腎的另一半用勻漿器碾磨3500 r/min 4℃離心10 min，取上清液待測腎臟組織中apelin和AngⅡ水平。用ELISA法測腎臟、血清中apelin-12含量，放射免疫法測定腎臟、血漿中AngⅡ含量，硝酸還原酶法測血清中NO含量。

6 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 各組大鼠動脈壓的改變

各組間大鼠在術(shù)前血壓沒有明顯差異。從表1可知，術(shù)后4周RHR組收縮壓明顯升高，與假手術(shù)組比較有明顯差異(P＜0.01)，RHR組間差異不顯著(P＞0.05)。給藥后葛根素高、中劑量組與卡托普利組有明顯的降壓作用(P＜0.01);葛根素低劑量組在給藥4周后開始出現(xiàn)降壓效應(yīng)(P＜0.05)。隨著葛根素劑量的升高血壓下降越來越明顯。葛根素低劑量組與高劑量組及卡托普利組在各個測壓時點(diǎn)收縮壓均有顯著差異。

表1 各組大鼠不同時期收縮壓變化Table 1.The changes of systolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

表1 各組大鼠不同時期收縮壓變化Table 1.The changes of systolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.Pue:puerarin.

Sham 123.5±8.2 122.4±7.9 124.3±7.8 123.8±6.9 Model 179.4±8.6△△ 182.6±9.5△△ 190.3±9.2△△ 192.4±10.5△△Captopril treatment 30 189.8±11.5△△ 166.4±9.2△△＊＊ 159.7±10.5△△＊＊ 154.7 ±8.9△△＊＊Pue(high)treatment 100 183.4±7.6△△ 162.6±9.7△△＊＊ 157.9±8.7△△＊＊ 153.5 ±10.3△△＊＊Pue(middle)treatment 50 180.6±10.5△△ 169.8±9.2△△＊＊ 162.9±7.3△△＊＊ 159.8 ±8.2△△＊＊Pue(low)treatment 25 182.4±8.8△△ 178.1±9.3△△ 174.6±7.1△△＊ 171.3±9.6△△＊

從表2可知，術(shù)后4周RHR組舒張壓明顯升高，與假手術(shù)組比較差異明顯(P＜0.01)。RHR組間差異不顯著(P＞0.05)。給藥后葛根素高、中劑量組、卡托普利組與模型組比較降壓作用顯著(P＜0.01)。與收縮壓情況類似，給藥4周后低劑量葛根素亦能降低舒張壓(P＜0.05)。高劑量葛根素組與低劑量葛根素組之間有顯著差異(P＜0.05)。

表2 各組大鼠不同時期舒張壓變化Table 2.The changes of diastolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

表2 各組大鼠不同時期舒張壓變化Table 2.The changes of diastolic pressure in all groups(mmHg..n=8～9)

△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

Group Dose(mg·kg-1) 4 weeks after operation 2 weeks after administration 4 weeks after administration 6 weeks after administration Sham 89.7±8.2 90.1±6.2 89.4±7.1 91.2±6.7 Model 136.4±8.2△△ 138.6±6.3△△ 137.3±9.1△△ 140.7±10.3△△Captopril treatment 30 135.8 ±7.2△△ 121.4±9.5△△＊＊ 120.7±8.1△△＊＊ 119.6 ±6.1△△＊＊Pue(high)treatment 100 129.8 ±5.9△△ 118.2±7.3△△＊＊ 120.2±5.9△△＊＊ 118.5 ±8.6△△＊＊Pue(middle)treatment 50 130.6 ±9.6△△ 121.1±5.6△△＊＊ 124.5±6.3△△＊＊ 125.8 ±9.1△△＊＊Pue(low)treatment 25 134.7±7.9△△ 130.1±6.9△△ 129.6±8.4△△＊ 128.3±7.3△△＊

2 各組大鼠血清中apelin－12、NO和血漿中AngⅡ含量

從表3可知，葛根素高、中劑量組以及卡托普利組均能有效降低apelin-12和AngⅡ含量，升高NO含量，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。葛根素低劑量組血清中apelin-12含量下降不明顯，但有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。低劑量葛根素對AngⅡ和NO含量沒有明顯影響(P＞0.05)。

3 各組大鼠腎臟中apelin－12和AngⅡ含量

從圖1可知，模型組腎臟中apelin-12含量明顯升高，與假手術(shù)組比較，差異顯著(P＜0.01)。隨著葛根素劑量的升高，腎臟中Apelin-12含量逐漸降低，各葛根素組與模型組比較，均有顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)。

如圖2所示，隨著葛根素劑量的增加，腎臟中AngⅡ含量逐漸減少。葛根素高、中劑量組與模型組比較，有明顯差異(P＜0.01);葛根素低劑量亦能降低腎臟中AngⅡ含量，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表3 各組大鼠血清中apelin－12、NO和血漿中AngⅡ含量Table 3.Content of apelin-12，NO in serum and AngⅡ in plasma in all groups(.n=8～9)

表3 各組大鼠血清中apelin－12、NO和血漿中AngⅡ含量Table 3.Content of apelin-12，NO in serum and AngⅡ in plasma in all groups(.n=8～9)

△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.

Group Apelin-12(ng·L-1)AngⅡ(ng·L-1)NO(mol·L-1)Sham 186.8±11.5 212.3±10.5 52.3±9.5 Model 225.6±9.6△△ 262.1±9.7△△ 35.6±7.9△△Captopril treatment 194.7±8.4＊＊ 225.6±8.3＊＊ 50.3±6.7＊＊Pue(high)treatment 189.3±12.6＊＊ 220.2±10.1＊＊ 51.4±8.8＊＊Pue(middle)treatment 203.1±7.5＊＊ 234.5±11.3＊＊ 46.7±6.9＊＊Pue(low)treatment 212.4±10.3△△＊ 249.1±9.2△△ 41.8±5.2△

Figure 1.Apelin-12 level in kidneys in all groups..n=8～9.△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.圖1 各組大鼠腎臟中Apelin－12的含量

Figure 2.AngⅡlevel in kidneys in all groups..n=8～9.△△P ＜0.01 vs sham group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group.圖2 各組大鼠腎臟中AngⅡ的含量

討 論

腎性高血壓是一種常見的繼發(fā)性高血壓，其主要病因是腎動脈狹窄。由于腎血流量的減少，異常激活RAS［11］，導(dǎo)致鈉、水潴留，引起血壓升高。葛根素具有改善心腦血管循環(huán)、降壓等作用。本實(shí)驗(yàn)室以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果［6］顯示葛根素有明顯的降壓效果?？筛鸶貏┝颗c吳文華等［12］報道的偏大，這次所使用的葛根素劑量有所下降，結(jié)果表明，葛根素各劑量組均能有效降低血壓，收縮壓比舒張壓的降低程度更加明顯，而且隨著劑量的增加降壓效果越來越顯著。其降壓幅度與吳文華等實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同。與本實(shí)驗(yàn)室上次使用的葛根素降壓效果也大致相似，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能與動物的性別(上次為雌雄各半，本次均為雄性)、個體差異(不同批次的動物)有關(guān)。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶既可以水解血管緊張素，又可以降解apelin。Apelin雖不能與AT1受體直接結(jié)合，但APJ受體與AT1受體存在著密切關(guān)系，它們既有拮抗作用又有協(xié)同作用。Apelin是小分子活性多肽，在血管［13］、心臟［14-15］、大腦［16］中都有表達(dá)。Apelin可以調(diào)節(jié)血管的收縮功能，隨著AngⅡ濃度升高，apelin濃度會相應(yīng)升高，拮抗AngⅡ的升壓作用;AngⅡ濃度降低，apelin濃度也會相應(yīng)降低。目前研究apelin的作用大多測量它在組織器官中的表達(dá)水平，本課題組從北京博奧森生物技術(shù)有限公司購買了大鼠apelin-12 ELISA檢測試劑盒，測出血清及腎臟中apelin的含量。結(jié)果表明，模型組與假手術(shù)組比較，前者腎臟及血清中apelin-12含量、腎臟及血漿中AngⅡ含量升高，而血清中NO含量降低。隨著葛根素劑量的增加，降壓效果越來越明顯，同時，腎臟和血漿(或血清)中apelin-12和AngⅡ的含量逐漸降低，血清中NO的含量逐漸升高。這提示apelin-12與AngⅡ之間的相互拮抗作用以及NO的升高對降低血壓起了一定程度的作用。因此，我們認(rèn)為葛根素對腎性高血壓大鼠的降壓作用與其改變大鼠體內(nèi)apelin-12、AngⅡ和NO的含量及其平衡有關(guān)。但它們之間究竟是如何相互作用及其生理病理意義有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，葛根素對腎性高血壓大鼠具有降壓作用，其作用機(jī)制可能與其改變大鼠體內(nèi)apelin-12、AngⅡ和NO的含量及其平衡有關(guān)。

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