百里醌對血管生成及胰腺癌生長的影響*

劉 岸，王 武，陳 兆，吳志豪

(1溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027;2岳陽市第一人民醫(yī)院，湖南 岳陽 414000;3溫州醫(yī)學院附屬眼視光醫(yī)院，浙江 溫州 325000)

新生血管生成在惡性腫瘤生長和轉移中發(fā)揮了重要的作用，研究表明血管內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)具有自我增殖和定向歸巢的特性，可定向分化為血管內皮細胞，從而在新生血管生成中發(fā)揮重要作用。百里醌(thymoqinone)是近年來從產自中東國家的黑種草籽油中分離出來的主要有效單體，研究發(fā)現(xiàn)其具有強大的抑癌效應，可抑制多種惡性腫瘤細胞生長和轉移［1，2］，還能抑制人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)介導的血管生長［3］。但百里醌對EPCs的影響以及對人胰腺癌血管生長的抑制作用卻未見報道。因此，本研究將探討百里醌對EPCs體外小管生成的影響以及對人胰腺癌血管生長的影響及其可能機制，為百里醌的臨床應用提供一定的實驗依據。

材料和方法

1 主要藥品和試劑

百里醌購自Sigma;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、含EDTA胰酶和RPMI－1640培養(yǎng)基購自Gibco;EGM－2培養(yǎng)基購自Lonza;人工重組基底膜(Matrigel)購自BD;Ⅰ抗小鼠抗血管內皮生長因子受體－2(vascular endothelial growth factor receptor－2，VEGFR－2)單克隆抗體、兔抗VIII因子多克隆抗體購自Santa Cruz;Ⅰ抗兔抗CD34多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;人纖連蛋白(human fibronectin，HFN)購自Chemicon;ABC免疫組化檢測試劑盒和AEC染色試劑盒購自華美生物工程公司;血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和β－actin抗體購自Epitomics。百里醌用無水乙醇配制成10 mmol/L，－20℃冰箱保存，使用時用不含血清的RPMI－1640培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

2 方法

2.1 細胞株及細胞培養(yǎng) 人胰腺癌細胞株PANC－1為本實驗室保存，培養(yǎng)在含10%胎牛血清、質量濃度1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞單層貼壁生長，至70% ～80%融合時胰蛋白酶消化傳代。

2.2 EPCs的分離和培養(yǎng) 參照楊德業(yè)等［4］的方法收集2010年9月～2010年12月棄用的健康新生兒臍帶血液5例(溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院產科)，每次采集臍血量約30 mL。采用密度梯度離心法收集臍血中的單個核細胞接種在包被有HFN 10 cm2培養(yǎng)皿中。加入3 mL含10%FBS EGM－2培養(yǎng)液，24 h后更換全部培養(yǎng)液。此后7 d內每天更換50%的培養(yǎng)液，7 d后每3 d更換全部培養(yǎng)液，同時觀察細胞生長情況，待原代細胞生長匯合后傳代進行下一步實驗。

2.3 EPCs的鑒定 取第2代細胞接種至24孔板中，培養(yǎng)至貼壁。采用40 g/L多聚甲醛固定20 min，0.3%H2O2－甲醇液封閉內源性過氧化物酶10 min，PBS浸洗后分別加1∶100稀釋的Ⅰ抗小鼠抗VEGFR－2，兔抗VIII因子相關抗原抗體及兔抗CD34抗體于4℃下孵育過夜。Ⅱ抗結合參照ABC免疫組化檢測試劑盒說明書進行，之后用AEC染色試劑染色，蘇木素復染，在倒置相差顯微鏡下(Nikon，TS100)觀察染色結果。陰性對照組為胰腺癌細胞株PANC－1。

2.4 動物 雌性BALB/c－nu/nu品系的裸小鼠(4－6周齡)，體重18－20 g，購自中科院上海動物實驗中心，許可證號為SCXK(滬)2007－0005。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)學院SPF級屏障系統(tǒng)的潔凈層流架內，室溫控制在(25±1)℃，相對濕度40% ～60%，動物所需飼料、飲水、籠具和操作器材及其它用品均滅菌處理后使用，實驗時按無菌原則操作。

2.5 小管形成實驗 4℃下于96孔板中每孔加入100 μL Matrigel，鋪平后置37℃培養(yǎng)箱內固定5 h。以4×104cells/well接種于培養(yǎng)板，加入不同濃度百里醌(10 nmol/L、20 nmol/L和40 nmol/L)，以溶媒為對照組，每組設5個復孔。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后，倒置顯微鏡下觀察并拍照，并計算不同濃度百里醌作用后EPCs小管生成的抑制率。

2.6 Western印跡檢測PANC－1細胞中VEGF的表達 收集處于對數生長期的胰腺癌PANC－1細胞，不同濃度百里醌(20 μmol/L、40 μmol/L 和80 μmol/L)(微摩爾級濃度百里醌對于EPCs來說濃度太高，20 μmol/L的百里醌作用48 h可完全殺滅該細胞，因此作用EPCs的百里醌選用納摩爾級濃度)作用PANC－1細胞48 h后，RIPA裂解液裂解細胞，提取上清液，測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品(20 μg/well)，8%SDS－PAGE電泳，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉后滴加兔抗人VEGF抗體為第Ⅰ抗體，HRP標記的羊抗兔IgG為第Ⅱ抗體，ECL顯色，X線膠片曝光。

2.7 裸鼠胰腺癌原位移植瘤模型制備及實驗干預

①制備胰腺癌皮下移植瘤模型 取3×106個對數生長期的PANC－1細胞懸浮為0.2 mL細胞懸液，注射至裸鼠腋部皮下，待腫瘤生長成1 cm×1 cm×1 cm大小后取出，無菌條件下去除中央壞死組織，選取周圍健康腫瘤組織剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊。

②制備外科胰腺癌原位移植模型 戊巴比妥鈉(50 mg/kg BW)腹腔麻醉裸鼠，經左上腹直腸旁線切口后，仔細暴露胰腺，術者佩戴手術放大鏡后小心剪開胰腺被膜，將瘤塊植入胰尾處。以8－0可吸收外科縫線縫合胰腺被膜，將胰腺輕輕送回腹腔，6－0可吸收外科縫線單層縫合腹壁肌層及皮膚。以上所有操作均在超凈臺內進行。共制備20只裸鼠，隨機分成2組，每組10只。手術后第3周開始給藥，對照組每只裸鼠1%乙醇0.2 mL灌胃;百里醌給藥采用灌胃，劑量為20 mg/kg［2］，每周3次，持續(xù)給藥3周。術后第8周處死老鼠，并計算裸鼠8周生存率;鼠重變化ΔBW(g)=治療后鼠重－治療前鼠重;抑瘤率 =1－治療組與對照組腫瘤實際重量的比值。

2.8 免疫組織化學法檢測裸鼠胰腺腫瘤組織中Ki－67、CD34和VEGF的表達 每組各選取5個腫瘤組織，按照Envision法的操作步驟進行免疫組化實驗，選取新鮮腫瘤組織經石蠟切片常規(guī)脫蠟水化、Ⅰ抗孵育和封片后低倍鏡(×100)下尋取血管密度最高的區(qū)域，然后高倍鏡(×400)下隨機選擇20個視野，計數每個視野中CD34陽性細胞數;同時在高倍鏡下隨機選擇20個視野，計算每個視野中Ki－67和VEGF陽性細胞所占比例。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 EPCs鑒定結果

用免疫細胞染色法對細胞染色后發(fā)現(xiàn)細胞表面相關抗原VEGFR－2、VIII因子和 CD34表達均為陽性，見圖1，此類細胞被認為是正在分化的EPCs。檢測胰腺癌PANC－1細胞各抗體表達均為陰性。

Figure 1.Expression of VEGFR－2(A)，Ⅷ factor(B)and CD34(C)in EPCs(×400).圖1 EPCs細胞經細胞免疫組化染色檢測VEGFR－2、VⅢ因子和CD34的表達

2 百里醌對EPCs體外血管生成的抑制作用

不同濃度百里醌(10 nmol/L、20 nmol/L和40 nmol/L)作用EPCs 12 h后，倒置顯微鏡下觀察，低濃度百里醌(10 nmol/L)對EPCs小管形成無明顯影響，20 nmol/L百里醌開始顯著抑制小管生成，不僅小管數目減少，而且管腔不完整;以40 nmol/L百里醌抑制EPCs小管生成的效應最顯著，見圖2。

Figure 2.Inhibitory effect of thymoquinone on tubule－like structure formation of EPCs.A:EPCs were cultured on a layer of Matrigel in the presence or absence of thymoquinone for 12 h，and tube formation was determined using a optical microscope(×200);B:tubule－like structure was quantified by manual counting..n=3.*P ＜ 0.05 vs control圖2 百里醌對體外EPCs小管形成的影響

3 百里醌對胰腺癌PANC－1細胞中VEGF表達的影響

Western blotting結果表明，低濃度(20 μmol/L)百里醌對胰腺癌細胞VEGF蛋白表達無明顯影響，但高濃度(40～80 μmol/L)的百里醌顯著抑制胰腺癌細胞中VEGF蛋白的表達水平，以80 μmol/L百里醌抑制作用最明顯，見圖3。

4 百里醌對體內胰腺癌生長的抑制作用

實驗結束后，對照組和百里醌組的鼠重均有不同程度的降低，但對照組的裸鼠體重下降更為明顯(P＜0.05);實驗組少量裸鼠治療期間出現(xiàn)腹瀉、稀便及脫水表現(xiàn)，但療程結束也隨之停止。實驗第56 d處死動物后，百里醌組腫瘤平均重量為(0.27±0.06)g，與對照組［(1.12 ±0.22)g］相比較差異顯著(P＜0.05);但百里醌組對胰腺腫瘤預后無明顯影響，見表1。

Figure 3.Western blotting analysis of VEGF in whole cell lysates of PANC－1 cells after treated with various concentrations of thymoquinone for 48 h.β － actin protein served as loading control..n=3.*P ＜ 0.05 vs control.圖3 不同濃度的百里醌作用于人胰腺癌PANC－1細胞48 h后對VEGF蛋白表達的影響

表1 百里醌對荷瘤裸鼠體重、胰腺腫瘤重量、抑瘤率及生存率的影響Table 1.Effects of thymoquinone on body weight，tumor weight，inhibitory rate and survival rate in tumor－bearing nude mice(.n=10)

表1 百里醌對荷瘤裸鼠體重、胰腺腫瘤重量、抑瘤率及生存率的影響Table 1.Effects of thymoquinone on body weight，tumor weight，inhibitory rate and survival rate in tumor－bearing nude mice(.n=10)

*P ＜0.05 vs control.

Group Tumor weight(g)Inhibitory rate(%)Survival rate(%) ΔBW(g)Control 1.12±0.22 － 80%(8/10)－0.46 ±0.19 Thymoquinone0.27 ±0.06* 75.9 90%(9/10) －0.15 ±0.07*

5 免疫組織化學法檢測裸鼠胰腺腫瘤組織中Ki－67、CD34和VEGF蛋白表達

如圖4所示，免疫組織化學染色可見對照組腫瘤組織中大量細胞Ki－67、CD34和VEGF陽性表達。與對照組相比較，百里醌組腫瘤組織中Ki－67、CD34和VEGF陽性表達細胞均明顯減少，見表2。各組腫瘤組織切片經PBS代替特異性Ⅰ抗作為空白對照，腫瘤組織切片鏡下均無陽性表達。

討 論

Figure 4.Immunohistochemistry for Ki－67，CD34 and VEGF protein expression in harvested tumors from tumorbearing nude mice(×400).圖4 免疫組織化學法檢測百里醌對裸鼠胰腺癌原位移植瘤中Ki－67、CD34和VEGF表達的影響

表2 百里醌對腫瘤組織中Ki－67、CD34和VEGF表達的影響Table 2.Effects of thymoquinone on the expression of Ki－67，CD34 and VEGF in pancreatic cancer samples(.n=20)

表2 百里醌對腫瘤組織中Ki－67、CD34和VEGF表達的影響Table 2.Effects of thymoquinone on the expression of Ki－67，CD34 and VEGF in pancreatic cancer samples(.n=20)

*P ＜0.05 vs control group.

Group Ki－67(%)CD34+vesselsVEGF(%)Control 73.8 ±11.5 17.4 ±3.8 81.6 ±6.5 Thymoquinone 43.6 ±9.6* 6.2 ±1.9* 35.7 ±5.7*

在腫瘤生長過程中，腫瘤大小超過1～2 mm就需要持續(xù)血供才能維系生長［5］，而且新生血管在腫瘤組織中呈廣泛而不規(guī)則生長，血管吻合顯著增多。一旦腫瘤細胞擁有誘導血管生長的能力，腫瘤生長變得極富有侵犯性，從而為腫瘤侵襲和轉移提供便利。近幾十年來，F(xiàn)olkman 等［6］和 Kerbel等［7］發(fā)現(xiàn)，抑制腫瘤血管生長可抑制腫瘤生長和轉移，從而改善病人預后。遺憾的是，當前發(fā)現(xiàn)的血管抑制劑具有一定的毒副作用，如COX－2抑制劑塞來昔布可引起粒細胞減少和貧血等不良反應［8］。因此，尋求一種天然低毒的血管抑制劑成為抗癌治療的迫切需要。在以往研究中，百里醌顯示出強大的抑瘤效應，且沒有明顯的細胞毒性［1］，同時，該藥可有效抑制HUVECs增殖及其功能，從而在其抑制前列腺癌生長中發(fā)揮了一定的作用［3］。這些提示百里醌可以作為一種新型血管生成抑制劑用于腫瘤治療。

新生血管形成是由一系列步驟組成的生物學過程，包括內皮細胞增殖和遷移、血管管腔的形成與存活［9，10］。作為多種內皮細胞的前體細胞 EPCs是一種來源于骨髓的干細胞，具有運動、增殖和分化為成熟內皮細胞的能力，EPCs在機體腫瘤血管新生過程中起到重要作用。首先，EPCs數量下降會引起血管修復能力下降，從而引發(fā)心血管事件［11］;其次，體外注射EPCs可顯著改善肢體血管新生［12］，加速血液循環(huán)［13］;再次，在新生血管形成中，EPCs占內皮細胞總數的25%之多［14］;最后，EPCs在腫瘤生長的早期起到至關重要的作用［15］。在本研究中，我們成功培養(yǎng)出人臍血 EPCs，并經 VEGFR－2、VIII因子和CD34細胞免疫組化證實細胞的內皮屬性，且首次發(fā)現(xiàn)低濃度百里醌可顯著抑制體外EPCs小管形成，具有抑制體外血管生成的能力，與文獻報道相近［3］;另外，在體內實驗中，我們建立起胰腺癌原位移植模型，發(fā)現(xiàn)百里醌不僅可在對機體無明顯影響的前提下抑制體內胰腺腫瘤生長，還可顯著抑制胰腺腫瘤中CD34陽性表達，表明百里醌可抑制包括EPCs在內的內皮細胞在胰腺腫瘤中的血管生成，與我們設想相符。上述結果提示里醌作為一種低毒的抑瘤藥物可通過抑制EPCs體內外血管生成，從而可能在其抑制胰腺腫瘤生長中發(fā)揮了一定的作用。

VEGF是一種重要的血管新生依賴因子，它一方面可通過增強血管的通透性引起纖維蛋白原等血漿蛋白的外滲，為腫瘤細胞的生長和新生毛細血管網提供最佳基質;另一方面與其受體結合，發(fā)揮特異性的內皮細胞分裂原的活性，刺激血管內皮細胞增殖，從而促進血管的新生［7］。大多數腫瘤細胞可分泌VEGF，但缺乏VEGF受體，而內皮細胞表達VEGF受體卻很少表達VEGF，因此VEGF在促進內皮細胞在腫瘤組織形成血管的過程中發(fā)揮了重要作用。最新研究表明，抗VEGF藥物bevacizumab已成為治療乳腺癌的一線化療藥物［16］，顯示血管生成抑制劑良好的抗癌前景。在本研究中，胰腺癌細胞株PANC－1中VEGF呈高表達狀態(tài)，而百里醌不僅可抑制體外胰腺癌細胞中VEGF的表達，還能有效下調體內胰腺腫瘤中VEGF的表達，表明百里醌可通過下調VEGF而抑制胰腺腫瘤中血管生成。

［1］Banerjee S，Kaseb AO，Wang Z，et al.Antitumor activity of gemcitabine and oxaliplatin is augmented by thymoquinone in pancreatic cancer［J］.Cancer Res，2009，69(13):5575－5583.

［2］Jafri SH，Glass J，Shi R，et al.Thymoquinone and cisplatin as a therapeutic combination in lung cancer:In vitro and in vivo［J］.J Exp Clin Cancer Res，2010，29:87.

［3］Yi T，Cho SG，Yi Z，et al.Thymoquinone inhibits tumor angiogenesis and tumor growth through suppressing AKT and extracellular signal－regulated kinase signaling pathways［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(7):1789 －1796.

［4］楊德業(yè)，張懷勤，季抗挺，等.內皮祖細胞在體外培養(yǎng)成血管樣結構的初步觀察［J］.中國病理生理雜志，2006，22(10):1970－1974.

［5］Seno H，Oshima M，Ishikawa TO，et al.Cyclooxygenase 2－and prostaglandin E2receptor EP2－dependent angiogenesis in ApcΔ716mouse intestinal polyps［J］.Cancer Res，2002，62(2):506 －511.

［6］Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications［J］.N Engl J Med，1971，285(21):1182－1186.

［7］Kerbel RS.Tumor angiogenesis［J］.N Engl J Med，2008，358(19):2039－2049.

［8］Dragovich T，Burris H 3rd，Loehrer P，et al.Gemcitabine plus celecoxib in patients with advanced or metastatic pancreatic adenocarcinoma:results of a phase Ⅱ trial［J］.Am J Clin Oncol，2008，31(2):157 －162.

［9］方 英，傅國勝，宋筱筱，等.雷公藤內酯醇對外周血內皮祖細胞的影響［J］.中國病理生理雜志，2008，24(12):2315－2318.

［10］Bussolino F，Mantovani A，Persico G.Molecular mechanisms of blood vessel formation［J］.Trends Biochem Sci，1997，22(7):251－256.

［11］Kunz GA，Liang G，Cuculi F，et al.Circulating endothelial progenitor cells predict coronary artery disease severity［J］.Am Heart J，2006，152(1):190 －195.

［12］Murohara T，Ikeda H，Duan J，et al.Transplanted cord blood－derived endothelial precursor cells augment postnatal neovascularization［J］.J Clin Invest，2000，105(11):1527－1536.

［13］Schatteman GC，Hanlon HD，Jiao C，et al.Blood－derived angioblasts accelerate blood－flow restoration in diabetic mice［J］.J Clin Invest，2000，106(4):571 －578.

［14］Suzuki T，Nishida M，F(xiàn)utami S，et al.Neoendothelialization after peripheral blood stem cell transplantation in humans.A case report of a Tokaimura nuclear accident victim［J］.Cardiovasc Res，2003，58(2):487 －492.

［15］Nolan DJ，Ciarrocchi A，Mellick AS，et al.Bone marrow－derived endothelial progenitor cells are a major determinant of nascent tumor neovascularization［J］.Genes Dev，2007，21(12):1546－1558.

［16］Scott LJ.Bevacizumab:in first－ line treatment of metastatic breast cancer［J］.Drugs，2007，67(12):1793 －1799.