二甲雙胍對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠LPIN1表達(dá)及AMPK通路的作用*

莊向華，劉元濤，倪一虹，孫福敦，陳詩鴻

(山東大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 濟(jì)南 250033)

脂肪組織作為一種內(nèi)分泌器官，可分泌多種脂肪因子如瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素、內(nèi)脂素等，在糖脂代謝調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要的作用［1］。LPIN1蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的基因LPIN1表達(dá)蛋白，在fld小鼠中基因缺失，其作用缺陷可以導(dǎo)致脂肪細(xì)胞分化障礙、糖代謝受損、高脂血癥［2］。動(dòng)物研究表明LPIN1基因表達(dá)與肥胖、胰島素抵抗負(fù)相關(guān)。LPIN1的生理學(xué)作用目前尚未完全明確。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一種重要的蛋白激酶，能調(diào)節(jié)能量代謝，被稱為“能量感受器”。除調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝外，AMPK也參與機(jī)體胰島素敏感性的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)，AMPK基因剔除可誘導(dǎo)小鼠胰島素抵抗;而AMPK過表達(dá)或AMPK特異性激活劑均具有胰島素增敏效應(yīng)［3］。二甲雙胍可以激活A(yù)MPK信號(hào)通路，抑制肝臟的糖異生，促進(jìn)脂肪酸氧化，改善胰島素敏感性。本課題從肝臟胰島素抵抗發(fā)病機(jī)制出發(fā)，通過高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，觀察大鼠肝臟LPIN1和AMPKα表達(dá)、活性的變化。造模成功后應(yīng)用二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)，探討LPIN1在胰島素抵抗發(fā)生過程中可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

雄性Wistar大鼠36只，購于山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重160～200 g，動(dòng)物的飼養(yǎng)遵照山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)規(guī)定。給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由取食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為2組:對(duì)照組(control，Con組)12只，給予大鼠食用的標(biāo)準(zhǔn)飼料，含有5%的脂肪、53%碳水化合物、23%蛋白質(zhì)，熱量含量為25 kJ/kg;高脂飼養(yǎng)組(high-fat diet，HF組)24只，給予高脂飲食，含有22%脂肪、48%碳水化合物以及20% 蛋白質(zhì)，熱量含量為44.3 kJ/kg［4］。高脂飲食飼料購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司。每周監(jiān)測(cè)大鼠體重和血糖。實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)8周后將高脂組大鼠隨機(jī)分為高脂(HF)組12只和二甲雙胍干預(yù)(metformin intervention，MET)組12只，2組除繼續(xù)喂以高脂飼料外，MET組用二甲雙胍灌胃，劑量為200 mg·kg-1·d-1，每周稱重1次，據(jù)此調(diào)整劑量;Con組應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)飼料繼續(xù)喂養(yǎng)8周。第16周末再次行鉗夾實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組IR情況。大鼠過夜空腹12 h，鉗夾實(shí)驗(yàn)前頸動(dòng)脈取血測(cè)定血糖，并分離血清于-70℃保存用于生化指標(biāo)檢測(cè);鉗夾實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，留取肝臟標(biāo)本-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 高胰島素－正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)［5］

實(shí)驗(yàn)前4～5 d在麻醉下行頸動(dòng)脈和頸靜脈埋植式插管術(shù)，在動(dòng)物清醒、自由活動(dòng)狀態(tài)下行鉗夾實(shí)驗(yàn)。將諾和靈R以13mU·kg-1·min-1的速度持續(xù)泵入，每10 min監(jiān)測(cè)1次血糖，保持血糖在4.5～5.5 mmol/L范圍內(nèi)，達(dá)到穩(wěn)態(tài)，進(jìn)行120 min，計(jì)算葡萄糖輸注率(glucose infusion rate，GIR)。

3 生化指標(biāo)檢測(cè)

大鼠尾靜脈取血，離心后分離血清，將血清樣品放入低溫冰箱中保存，供測(cè)定時(shí)使用。血糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法，使用美國強(qiáng)生公司(Life Scan)強(qiáng)生穩(wěn)豪型OneTouch UltraEasy血糖儀。血清胰島素采用放射免疫法測(cè)定(Linco Research)。血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)水平應(yīng)用Beckman DXC 800型生化自動(dòng)分析儀測(cè)定。

4 肝臟TG和TC含量分析

［6］方法進(jìn)行，組織經(jīng)氯仿/甲醇抽提后用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定。稱取100 mg組織標(biāo)本放入1 mL氯仿/甲醇(體積比為2∶1)中，用電動(dòng)勻漿器勻漿。勻漿移入干凈試管中，在室溫下?lián)u動(dòng)過夜，然后加入1 mL 0.6%氯化鈉混勻，2000 r/min離心15 min使水與有機(jī)界面分開，底層的氯仿層小心移入玻璃管，用氮?dú)獯蹈珊笤偃苡谶m量乙醇中，用全自動(dòng)生化分析儀(Beckman)測(cè)定。

5 實(shí)時(shí)定量real－time PCR方法檢測(cè)基因表達(dá)

應(yīng)用實(shí)時(shí)定量 PCR檢測(cè) LPIN1、AMPKα1、AMPKα2和β-actin mRNA的表達(dá)。采用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA，取100 mg左右的肝臟組織，按照說明書操作，RNA于紫外分光光度計(jì)定量后于-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒合成cDNA，按照說明書操作。PCR反應(yīng)條件:95℃3 min，93 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。于每個(gè)循環(huán)延伸反應(yīng)最后時(shí)刻收集熒光信號(hào)。熔解曲線設(shè)置:95℃ 1 s，60℃ 2 min，以0.2℃/s的升溫速度升溫至95℃，升溫時(shí)連續(xù)收集熒光信號(hào)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI Prism 7500 Detection System)檢測(cè)。PCR引物由上海生物工程公司合成，引物設(shè)計(jì)如下:AMPKα1正義鏈5'-CATTCTTGGTTGCCGAAACA-3'， 反義鏈5'-TGTTTGGATTTCTGTGGGTT-3';AMPKα2正義鏈5'-TGTAAACACGGGAGGGTTGAA-3'，反義鏈5'-GGCAGACAGAATCTGCTGGAA-3';LPIN1正義鏈5'-CGCCAAAGAATAACCTGGAA-3'，反義鏈 5'-TGAAGACTCGCTGTGAATGG-3';β-actin正義鏈5'-TGGTGGACCTCATGGCCTAC-3'，反義鏈5'-CAGCAACTGAGGGCCTCTCT-3'。

6 Western blotting方法檢測(cè)蛋白水平表達(dá)

在冰凍緩沖液中研碎肝臟組織，提取蛋白，在4℃ 20000 r/min離心20 min，小心吸取上清，用BCA法，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白擬合曲線，計(jì)算蛋白濃度，確定上樣量。取50 μg蛋白在95℃溫度下變性5 min，SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。封閉1 h，應(yīng)用p-AMPKα (Thr172)(Santa Cruz)、AMPKα1、AMPKα2(Abcam)和 LPIN1(Santa Cruz)抗體孵育，加5 μLⅡ抗(1∶2000稀釋)與10 mL封閉緩沖液中充分混勻，加入硝纖膜。取出硝纖膜放入發(fā)光液，反復(fù)澆硝纖膜約5 min，取出硝纖膜，吸干過多液體，保鮮膜包裹硝纖膜，置于曝光盒中曝光、顯影、定影。GAPDH為內(nèi)參照，用多功能數(shù)字圖像分析儀Kodak Digital Science ID軟件進(jìn)行分析。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 一般情況和體重變化

實(shí)驗(yàn)組大鼠給予高脂飲食后，HF組大鼠與Con組相比，體重、空腹血糖、空腹胰島素顯著增高。血漿中和肝臟內(nèi)TG、TC水平明顯升高(P＜0.01)。HF組動(dòng)物 GIR值［(18.80±1.57)mg·kg-1·min-1］較 Con 組 ［(24.31 ±2.65)mg·kg-1·min-1］顯著降低(P＜0.01)，提示存在胰島素抵抗。應(yīng)用二甲雙胍進(jìn)行干預(yù)后，MET組體重、空腹胰島素、空腹血糖、TG和TC水平均較HF組下降，有顯著差異。MET組GIR值［(21.35±1.26)mg·kg-1·min-1］較HF組顯著提高(P＜0.05)，提示胰島素抵抗較HF組改善，見表1。

表1 3組大鼠體重、血清學(xué)指標(biāo)以及肝臟脂肪含量的變化Table 1.Changes of body weight，serum indexes and hepatic lipid profiles in the three groups(.n=12)

表1 3組大鼠體重、血清學(xué)指標(biāo)以及肝臟脂肪含量的變化Table 1.Changes of body weight，serum indexes and hepatic lipid profiles in the three groups(.n=12)

*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs Con group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs HF group.Con:control;BW:body weight;FBS:fasting blood sugar;FINS:fasting insulin;TG:triglyceride;TC:total cholesterol;GIR:glucose infusion rate;HF:high fat;MET:metformin.

Group BW(g)FBS(mmol/L)FINS(mU/L)TG(mmol/L)TC(mmol/L)GIR(mg·kg-1·min-1)TG in liver(mmol/g)TC in liver(mmol/g)Con 360±15 5.10±0.44 19.35±6.38 0.83±0.39 1.14±0.24 24.31±2.65 0.48±0.28 0.26±0.08 HF 438±24＊＊ 7.07±1.61* 23.70±7.37* 3.21±1.44＊＊ 3.04±1.62＊＊ 18.80±1.57＊＊ 0.89±0.31＊＊ 0.46±0.20＊＊MET 380±18# 6.32±0.95# 18.19±4.27# 1.36±0.24## 1.85±1.39# 21.35±1.26# 0.57±0.29# 0.31±0.18#

2 LPIN1(mRNA和蛋白)表達(dá)

與對(duì)照組相比，HF組大鼠肝臟組織中LPIN1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)，LPIN1蛋白表達(dá)水平減少(P＜0.01)。應(yīng)用二甲雙胍干預(yù)后，大鼠LPIN1 mRNA表達(dá)水平較HF組增加(P＜0.01);LPIN1蛋白表達(dá)水平增加(P＜0.01)，見圖1、2。

Figure 1.The mRNA expression of LPIN1，AMPKα1 ，and AMPKα2.＊＊P ＜ 0.01 vs Con group;▲▲P ＜0.01 vs HF group.圖1 LPIN1、AMPKα1和AMPKα2 mRNA表達(dá)

Figure 2.LPIN1 expression in rat livers in the three groups.＊＊P＜ 0.01 vs Con group;▲▲P＜0.01 vs HF group.圖2 3組大鼠中肝臟LPIN1蛋白表達(dá)

3 AMPKα(mRNA和蛋白)和 p－AMPKα活性變化

3組大鼠肝臟組織AMPKα1和AMPKα2 mRNA和蛋白表達(dá)均無顯著差異。與Con組大鼠相比，HF組大鼠p-AMPKα(Thr-172)蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01);與HF組相比，應(yīng)用二甲雙胍干預(yù)后p-AMPKα(Thr-172)的表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，見圖 1、3。

Figure 3.AMPKα1，AMPKα2 and p-AMPKα expression in rat livers in the three groups.＊＊ P ＜ 0.01 vs Con group;▲▲P ＜0.01 vs HF group.圖3 3組動(dòng)物肝臟中 AMPKα1、AMPKα2和 p－AMPKα蛋白表達(dá)

討 論

Lipin是雙向調(diào)控身體脂肪代謝的一個(gè)家族，由脂素基因(LPIN)所表達(dá)產(chǎn)生，包括LPIN1、LPIN2和LPIN3。LPIN1在脂肪組織、肝臟、骨骼肌、心臟等多種組織表達(dá)［7］，在脂質(zhì)合成和基因表達(dá)方面有雙重作用，一是作為磷脂酸磷酸酶 (PAP)1發(fā)揮促進(jìn)甘油三酯、磷脂合成作用;二是作為轉(zhuǎn)錄協(xié)同刺激因子聯(lián)系肝過氧化物酶體增殖物活化受體(PPAR)γ協(xié)同刺激因子1α(PGC1α)和PPARα，調(diào)節(jié)脂肪酸利用和脂肪合成基因表達(dá)［7-8］。研究證明LPIN1和胰島素抵抗密切相關(guān)，aP2轉(zhuǎn)基因鼠中LPIN1的表達(dá)和胰島素敏感性有關(guān)，其肝臟和脂肪組織中LPIN1表達(dá)水平與血漿胰島素濃度負(fù)相關(guān)，而給予HepG2細(xì)胞中高胰島素環(huán)境后LPIN1表達(dá)下調(diào)［8］。芬蘭的研究發(fā)現(xiàn)人類脂肪組織中LPIN1 mRNA表達(dá)水平與血糖、胰島素、胰島素抵抗等負(fù)相關(guān)［9］。健康男性中的LPIN1 mRNA與運(yùn)動(dòng)過程中呼吸商、氧消耗等相關(guān)，與脂肪酸代謝相關(guān)蛋白包括PPAR等表達(dá)正相關(guān)［10］。Harris等［11］研究發(fā)現(xiàn)在胰島素信號(hào)通路中LPIN1是下游靶基因，在胰島素的刺激作用下，LPIN1蛋白絲氨酸、蘇氨酸位點(diǎn)磷酸化。

肝臟是能量代謝的重要器官，也是胰島素作用的主要靶器官，維持空腹?fàn)顟B(tài)下內(nèi)生性糖的產(chǎn)生和輸出、進(jìn)食后糖的吸收、利用和存儲(chǔ)。本研究采用高脂飲食造模，顯示與對(duì)照組相比，高脂組大鼠體重、空腹血糖、胰島素、血漿和肝臟中TG、TC水平顯著升高。應(yīng)用高胰島素-正葡萄糖鉗夾實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)胰島素抵抗，結(jié)果提示高脂飲食組大鼠的GIR顯著降低(P＜0.01)，LPIN1表達(dá)明顯下調(diào);應(yīng)用二甲雙胍干預(yù)后GIR值明顯增加，胰島素抵抗改善，而LPIN1表達(dá)水平也顯著增加，提示LPIN1與胰島素抵抗可能存在相關(guān)性。

具有胰島素增敏作用的口服降糖藥物二甲雙胍，近年來被證實(shí)為AMPK激活劑。它可通過激活A(yù)MPK抑制肝糖異生，脂質(zhì)合成，促進(jìn)肌肉對(duì)葡萄糖的攝取和利用。在肝細(xì)胞中二甲雙胍首先激活A(yù)MPK，AMPK中α亞單位(包括α1和α2)是催化亞單位，α亞基上172位蘇氨酸磷酸化后，可使乙酰輔酶A羧化酶失活，減少胞漿內(nèi)丙二酰輔酶A的含量，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂肪酸氧化，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)糖脂代謝，Liu等［12］發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期高脂環(huán)境可以顯著降低大鼠骨骼肌AMPKα表達(dá)和活性，證實(shí)AMPKα參與高脂環(huán)境誘導(dǎo)胰島素抵抗發(fā)生的機(jī)制。而本研究顯示高脂組大鼠肝臟中AMPKα表達(dá)無明顯改變，p-AMPKα(Thr-172)磷酸化水平顯著降低，二甲雙胍干預(yù)后p-AMPKα(Thr-172)表達(dá)水平較高脂組顯著增加，提示在胰島素抵抗發(fā)生以及二甲雙胍干預(yù)過程中主要是AMPKα活性的改變，與文獻(xiàn)資料［1］相符。許多脂肪因子，如瘦素、脂聯(lián)素，可通過AMPK在骨骼肌和肝臟中發(fā)揮作用。瘦素在外周組織通過AMPK活化而增加葡萄糖的攝取［13］。脂聯(lián)素改善代謝的過程與肝臟中AMPK激活進(jìn)而減少脂肪酸合成，增加線粒體脂肪酸氧化等有關(guān)［14］。LPIN1作為一種新的脂肪因子，與胰島素抵抗相關(guān)，除了已知的上述兩方面作用機(jī)制以外，是否與AMPK通路有關(guān)?目前此方面研究較少。Higashida等［15］應(yīng)用 AMPK激活劑AICAR處理大鼠股三頭肌6 h后，LPIN1 mRNA表達(dá)水平顯著增加。我們的研究結(jié)果顯示高脂動(dòng)物模型中，應(yīng)用AMPK的另一種激活劑二甲雙胍干預(yù)后AMPKα活性明顯改善，肝臟LPIN1基因以及蛋白表達(dá)均較 HF組明顯增加，進(jìn)一步提示大鼠肝臟中LPIN1在AMPK信號(hào)通路中可能存在作用，AMPK信號(hào)通路的激活可以增加LPIN1表達(dá)水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)糖脂代謝，在胰島素抵抗發(fā)生發(fā)展過程中起到調(diào)控作用。

總之，本研究證明在飲食導(dǎo)致的肥胖大鼠肝臟中LPIN1蛋白表達(dá)、p-AMPKα(Thr-172)磷酸化水平減少，二甲雙胍干預(yù)后二者表達(dá)水平增加。然而，該研究也存在一些不足之處。首先，LPIN1 mRNA通過選擇性剪接產(chǎn)生2個(gè)蛋白質(zhì)異構(gòu)體LPIN1α和LPIN1β，它們?cè)诓煌稽c(diǎn)共同調(diào)節(jié)糖脂代謝［2］。本研究中的引物和抗體不能區(qū)別2種異構(gòu)體。另外，本研究在基因和蛋白表達(dá)水平提示LPIN1可能在AMPK信號(hào)通路中存在潛在作用，未來研究可通過轉(zhuǎn)基因或基因沉默方法進(jìn)一步驗(yàn)證LPIN1和AMPK信號(hào)通路之間的確切調(diào)控機(jī)制。

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