小鼠銅綠假單胞菌慢性肺部感染樹突狀細(xì)胞的功能變化

朱松雷，丁鳳鳴，沈 策

上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200233

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，PA）是慢性呼吸道感染主要致病菌之一。它廣泛分布于自然界并在人體皮膚上定植，是引起肺囊性纖維化 （CF）及彌漫性泛支氣管炎（DPB）等慢性感染的最重要的病原菌，也是近年來(lái)院內(nèi)感染的重要條件致病菌和耐藥菌之一。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）是目前所知功能最強(qiáng)的且唯一能激活初始性T細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞。本研究通過建立銅綠假單胞菌慢性肺部感染動(dòng)物模型，觀察小鼠肺部的病理學(xué)特點(diǎn)及肺臟DCs的變化及分泌細(xì)胞因子的應(yīng)答能力，探討肺臟DCs在慢性感染中的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康雌性Balb/c小鼠54只，體重18～21 g，7～8周齡，由上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院動(dòng)物房提供。銅綠假單胞菌菌株ATCC27853，購(gòu)于中國(guó)微生物中心。小鼠白介素23試劑盒購(gòu)于R&D公司。CD11c一抗、CD11c SABC免疫組化試劑盒 （武漢博士德），顯微病理成像系統(tǒng)（OLYMBUS BX41），CO2孵箱，烤箱，酶標(biāo)儀，比濁儀。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備

將54只小鼠分為兩組，PA組30只，經(jīng)氣管接種銅綠假單胞菌瓊脂糖珠懸液；對(duì)照組24只，經(jīng)氣管接種無(wú)菌瓊脂糖珠懸液。銅綠假單胞菌瓊脂糖珠的制備，參照于柏峰等[1]的方法并稍作改良制備。接種微量PA瓊脂糖珠懸液于去纖維羊血培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，用比濁儀調(diào)整菌落計(jì)數(shù)至5×109cfu/ml。用氯胺酮麻醉小鼠，將PA組小鼠固定在專用手術(shù)臺(tái)上，頸部前側(cè)用眼科剪剪一0.5 cm的豎切口，用眼科鑷剝離挑出氣管，用1 ml注射器注入40 μl銅綠假單胞菌瓊脂糖珠懸液。立即豎起小鼠輕輕搖晃，保持1 min，使菌液流下進(jìn)入肺內(nèi)，小鼠有類似嗆咳反應(yīng)。切開傷口不做處理，自然愈合。對(duì)照組給予同樣方法注入無(wú)菌瓊脂珠懸液。

1.3 標(biāo)本的采集及觀察項(xiàng)目

觀察試驗(yàn)后兩組小鼠的一般狀況，分別于接種后l、3、7、14 d用氯胺酮麻醉小鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈放血，用1 ml注射器進(jìn)行肺泡灌注，分3次，分別灌注0.8、0.5、0.5 ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS），收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），總回收液要＞1 ml。BALF中IL-23的測(cè)定方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求操作。檢測(cè)結(jié)果通過尿素稀釋倍數(shù)校正2。取游離新鮮的右肺做肺組織勻漿細(xì)菌培養(yǎng)。左肺肺臟立即用石蠟包埋，恒冷切片機(jī)切成厚度5 μm切片，粘于APES膠片上，一部分用HE染色觀察肺大體病理改變。另一部分行免疫組化，經(jīng)二甲苯及梯度乙醇脫蠟，微波爐抗原修復(fù)，加血清阻斷劑室溫20 min，加一抗兔抗小鼠 CD11c（1∶50 稀釋），37℃ 1 h，PBS 浸洗。 加入生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育20 min，PBS浸洗。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色 5～10 min。常規(guī)蘇木素核復(fù)染，脫水，透明及封片，光鏡觀察小鼠肺組織CD11c陽(yáng)性表達(dá)。以胞漿和胞膜染色呈棕黃色或黃色細(xì)胞為DCs陽(yáng)性細(xì)胞，免疫組化標(biāo)記的每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（400倍），計(jì)數(shù)所有染色陽(yáng)性的細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞陽(yáng)性率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×1000‰。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用兩樣本t檢驗(yàn)及F檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

PA組小鼠毛發(fā)紊亂，表情呆滯，活力明顯下降，進(jìn)食和飲水減少，3～4 d表現(xiàn)最明顯，5～7 d后狀況稍有改善，有2只小鼠分別在第3天和第4天死亡。對(duì)照組小鼠一般狀況明顯輕于PA組，2 d左右即可恢復(fù)正?；顒?dòng)和飲食，無(wú)一只死亡。

2.2 小鼠的病理形態(tài)學(xué)改變

光鏡下PA組感染早期肺細(xì)支氣管狹窄變形，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，局部出血，局灶性肺泡炎，見圖1。后期纖維增生明顯，可見肉芽腫形成，部分小鼠肺泡萎陷不張，出現(xiàn)小膿腫，淋巴細(xì)胞聚集表現(xiàn)，見圖2。對(duì)照組早期肺泡腔稍有滲出，3 d后基本恢復(fù)正常，見圖3。免疫組化發(fā)現(xiàn)PA組DCs在小鼠肺內(nèi)分布廣泛，氣管、支氣管、肺泡、臟層胸膜和氣管周圍相關(guān)淋巴組織及血管周圍均可見，但以氣管旁聚集明顯，見圖4。

圖1 PA組第3天肺組織病理改變，HE染色×100

圖2 PA組第14天肺組織病理改變，HE染色×100

圖3 對(duì)照組第3天肺組織病理改變，HE染色×100

2.3 兩組BALF中IL-23測(cè)定結(jié)果

PA組BALF中IL-23的水平早期升高明顯，第3天達(dá)到峰值，7 d后仍維持在較高的水平。對(duì)照組第1天就達(dá)到峰值，隨后下降，7 d后維持在穩(wěn)定水平。PA組第1、3、7、14天IL-23水平均高于對(duì)照組（P<0.05）。見表1。

2.4 小鼠肺組織CD11c免疫組化結(jié)果

PA組CD11c陽(yáng)性率第3天達(dá)到峰值，7 d后仍維持在較高的水平。對(duì)照組第1天就達(dá)到峰值，隨后下降，7 d后維持在一定水平。PA組第1、3、7、14天CD11c陽(yáng)性率均高于對(duì)照組（P<0.05）。 見表2。

3 討論

圖4 PA組肺組織免疫組化，SABC法×200

在研究PA慢性感染中，模型的建立是重要的一方面。本實(shí)驗(yàn)用瓊脂糖包埋細(xì)菌做成瓊脂珠，用富含致病菌的瓊脂珠灌注小鼠氣管。根據(jù)相關(guān)研究，該模型能夠客觀地反應(yīng)銅綠假單胞菌慢性感染特性，適合用來(lái)研究肺部慢性感染及纖維疾病的特征[3]。接種后于第1、3、7、14天分別對(duì)兩組小鼠分離肺組織，PA組除第7天有一只未培養(yǎng)出PA菌落，其余都能培養(yǎng)出PA菌落。而對(duì)照組未培養(yǎng)出PA菌落。PA組肺組織制備勻漿后，以每克肺組織所含菌落數(shù)來(lái)表示肺組織勻漿計(jì)數(shù)。PA組第7、14天的細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)均超過103cfu/g，證明此次慢性感染的動(dòng)物模型是成功的。

DCs作為抗原提呈細(xì)胞（APC），是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)者之一。同時(shí)，DCs還能夠誘導(dǎo)免疫耐受，調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答類型，在固有免疫應(yīng)答中作為效應(yīng)細(xì)胞抵抗微生物感染。作為引起慢性感染的代表菌PA，與DCs的關(guān)系非常復(fù)雜。有研究顯示小鼠的DCs有能力對(duì)PA外膜孔蛋白F進(jìn)行脈沖式的純化或重組以保護(hù)小鼠免受PA感染[4]。在研究燒傷小鼠中，與表皮全層燒傷的小鼠比較，受表皮部分層燒傷影響的DCs因釋放可溶性細(xì)胞因CCL3和 IL-12而能夠在PA感染中起預(yù)防作用[5]。因?yàn)镃D11c是分子量150 kD的αX亞單位β2整合素家族成員，是目前被廣泛應(yīng)用的樹突狀細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，文獻(xiàn)報(bào)道小鼠髓系和淋巴系DCs，包括DCs前體、未成熟及活化成熟的DCs均有較高的表達(dá)率[6]。筆者用CD11c作為小鼠的DCs標(biāo)志物，能夠比較好的評(píng)估小鼠肺臟DCs的變化。本實(shí)驗(yàn)免疫組化發(fā)現(xiàn)PA組DCs在小鼠肺內(nèi)分布廣泛，氣管、支氣管、肺泡、臟層胸膜和氣管周圍相關(guān)淋巴組織及血管周圍均可見，但以氣管旁聚集明顯。PA組免疫組化DCs陽(yáng)性率明顯高于對(duì)照組。因?yàn)镮L-23主要表達(dá)于DCs和巨噬細(xì)胞中，而相關(guān)的研究認(rèn)為像免疫調(diào)節(jié)因子IL-23的表達(dá)尤其可以作為DCs的重要特征之一[7]。本實(shí)驗(yàn)兩組小鼠BALF中IL-23水平的變化趨勢(shì)基本上與CD11c陽(yáng)性率的表達(dá)一致，因此可以認(rèn)為IL-23在一定程度上可以反應(yīng)DCs的功能變化。通過實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)PA組BALF中IL-23的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。筆者考慮在感染早期IL-23的作用可能是積極的，在早期IL-23可通過直接誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17，從而對(duì)病原體啟動(dòng)免疫反應(yīng)，開啟IL-23-IL-l7通路實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)。有資料顯示，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中若缺乏IL-23-IL-17迅速介導(dǎo)的免疫反應(yīng)則容易引起化膿性疾病[8]。在感染后期，PA組IL-23的水平雖較峰值下降，但比較對(duì)照組仍維持在較高的水平。IL-23的持續(xù)分泌能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增生，可能是肉芽組織的形成及慢性細(xì)菌性感染免疫反應(yīng)的一個(gè)重要因素[9]。因而筆者認(rèn)為IL-23在抗微生物反應(yīng)的長(zhǎng)久保持中可能起消極地作用。在臨床上，對(duì)于CF、DPB等PA慢性感染的治療，IL-23可能是中和或阻止炎癥反應(yīng)的一個(gè)有效靶標(biāo)。

表1 兩組第 1、3、7、14天BALF 中 IL-23測(cè)定結(jié)果比較（±s，ng/L）

表1 兩組第 1、3、7、14天BALF 中 IL-23測(cè)定結(jié)果比較（±s，ng/L）

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05

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表2 第1、3、7、14天小鼠肺組織CD11c免疫組化結(jié)果比較（±s，‰）

表2 第1、3、7、14天小鼠肺組織CD11c免疫組化結(jié)果比較（±s，‰）

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05

PA組對(duì)照組分組 第1天718.07±2.72*（n=7）13.52±3.51 （n=6）第3天21.68±5.36*（n=7）8.91±2.38（n=6）第7天16.65±2.18*（n=7）6.88±1.35（n=6）第14天15.42±2.06*（n=7）7.24±1.90（n=6）

綜上所述，在小鼠的PA慢性感染中，DCs對(duì)宿主起了重要的免疫調(diào)節(jié)作用，與其持續(xù)分泌的IL-23有很大的關(guān)系。通過相關(guān)途徑來(lái)降低IL-23的濃度可能為臨床上治療PA慢性感染提供了一個(gè)方向，有關(guān)的機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究探索。

[1]于柏峰,谷海瀛,翟英超,等.銅綠假單胞菌肺感染動(dòng)物模型的建立及相關(guān)炎癥反應(yīng)分析[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2010,30(8):717-721.

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