血管內(nèi)皮生長因子受體表達水平與胃癌臨床病理學特征的關系

楊 靜 ，景在平

1.上海市第七人民醫(yī)院外科，上海 200137；2.上海第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院，上海 200003

胃癌在導致死亡的惡性腫瘤中目前位居第二位[1]，在我國其發(fā)病率居常見惡性腫瘤的第四位[2]。眾所周知，中晚期胃癌患者預后較差，所以如何提高胃癌的早期診斷率并尋找出新的治療靶點，是當前胃癌研究的重要課題之一。

胃癌的發(fā)生與發(fā)展是多個步驟、不同階段和復雜基因的一個改變過程。其中腫瘤血管是腫瘤生長、轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)之一。因為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管的生成，任何實體瘤生長超過2 mm3都必須有新生腫瘤血管支持[3]。到目前為止，血管內(nèi)皮生長因子（Vascular Epidermal Growth Factor，VEGF）是已知的最強有力的血管生成因子，既能促進內(nèi)皮細胞的增殖、促進血管滲漏，還可特異性誘導淋巴管的形成，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起著至關重要的作用。然而VEGF的作用需要其與受體（Vascular Epidermal Growth Factor Receptor，VEGFR）結合才能發(fā)揮生物學效應。其受體在腫瘤細胞的病理生理機制中起著重要的作用[4]。目前已知的VEGF受體主要有以下 3種：VEGFR1（fms-liketyrosinekinase1，F(xiàn)lt-1），VEGFR2含有激酶插入?yún)^(qū)的受體KDR（在鼠中的同源序列被稱為 Flk-1，fetal liverkinase 1），VEGFR3 （F1t-4 和低分子量VEGFR）。那么VEGFR在胃癌分期和轉(zhuǎn)移中起著什么樣的作用呢？目前國內(nèi)外關于這三種受體與胃癌的分期和轉(zhuǎn)移的關系報道較少，而且研究結果也不盡一致。本研究采用免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）技術，檢測胃癌組織的VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3 的表達，進一步探討 VEGFR 與胃癌臨床病理學特征關系，為胃癌的早期識別及新治療靶點的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2008年9月～2010年9月在上海市第七人民醫(yī)院普外科住院，臨床病理資料完整的胃癌根治術后切除標本共53例。其中男38例，女15例，年齡50～75歲，病例無近期手術、創(chuàng)傷及其他惡性腫瘤等病史，無妊娠及嚴重心、肺、腦、腎、肝、血液系統(tǒng)等重大疾病。所有胃癌患者術前均未經(jīng)過任何放療、化療及生物治療。

根椐國際抗癌聯(lián)盟 (UICC)制定的國際TNM分期法（2002年UICC第6版）標準進行臨床分期，具體如下：

T：原發(fā)腫瘤。TX：原發(fā)腫瘤無法評估(包括資料不全、沒有記錄等)；T0：無原發(fā)腫瘤的證據(jù);Tis：原位癌，上皮內(nèi)癌未浸潤固有膜；T1：腫瘤浸潤至固有膜或粘膜下層；T2：腫瘤浸潤至肌層或漿膜下層；T2a：腫瘤侵及肌層；T2b：腫瘤侵及漿膜下層；T3：腫瘤穿透漿膜層，未侵及鄰近結構，當腫瘤可能已經(jīng)穿透肌層，并有胃結腸韌帶、肝胃韌帶或大小網(wǎng)膜侵犯，但沒有穿透這些組織的臟層腹膜時，仍分在T2中，如腫瘤穿透這些臟器覆蓋的臟層腹膜，則為T3；T4：腫瘤直接侵及鄰近結構。胃的鄰近結構包括：脾、橫結腸、肝、膈肌、胰腺、腹壁、腎上腺、腎、小腸和后腹膜。腫瘤由胃壁延伸到十二指腸或食管，由包括胃在內(nèi)的浸潤最嚴重處的深度決定T。

N：局部區(qū)域淋巴結。NX：區(qū)域淋巴結無法評估；N0：無區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移；不論切除及檢查的淋巴結總數(shù)，若所有的淋巴結都沒有轉(zhuǎn)移，定位pN0；N1：有1～6個區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移；N2：有7～15個區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移；N3：大于15個區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移。

M：遠處轉(zhuǎn)移。MX：無法評估遠處轉(zhuǎn)移；M0：未發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移；M1：有遠處轉(zhuǎn)移(包括肝十二指腸韌帶、胰腺后、腸系膜根部及腹主動脈旁的淋巴結受累)。

1.2 方法

免疫組織化學法測定腫瘤組織VEGFRs表達水平：術中切除原發(fā)灶后即刻取胃癌組織標本，以10%福爾馬林固定36～48 h，常規(guī)石蠟包埋，4 pm厚連續(xù)切片，依次經(jīng)二甲苯脫蠟、100%、95%、80%、70%梯度酒精復水?？乖迯筒捎貌Ｆ霗幟仕峋彌_液加熱至99℃保持30 min，再室溫自然冷卻。3%過氧化氫浸泡5 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶活性。一抗（I型膠原，1∶40， 購自上海長島），均以 1∶100 配成工作濃度，4℃孵育過夜。磷酸鹽緩沖液 （phosphate-buffered saline，PBS）洗滌2次后用生物素標記的二抗（上海長島）室溫孵育30 min，再用鏈酶素辣根過氧化物酶孵育30 min，DAB（上海長島）試劑盒顯色。蘇木精復染后封片。PBS代替一抗作為陰性對照，根據(jù)抗體說明書以大腸癌標本作為陽性對照。每張切片選取5個完整而不重疊的200倍視野，用Olympus BX51顯微鏡拍攝（日本），測定每個視野下陽性反應的平均光密度。圖像分析采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算每張圖片中陽性表達部分的平均光密度 （mean optical density，mean OD）。以每例5個視野的平均光密度的平均值作為該例的測量值（圖1）。

圖1 胃癌組織中的血管內(nèi)皮生長因子受體的表達（原始放大倍數(shù)×200倍）

1.3 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理。統(tǒng)計方法包括描述性分析、獨立樣本t檢驗、χ2檢驗、方差分析。以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 一般情況

共入組53例術后病理檢查證實為腺癌的胃癌患者，所有病例術前均未行放療或者化療，其中男38例，女15例，年齡50～75歲，平均年齡65.3歲。按UICC（2002）TNM分期：Ⅰ期3例，Ⅱ期6例，Ⅲ期34例（其中ⅢA 16例，ⅢB 18例），Ⅳ期10例。根據(jù)常規(guī)HE染色病理檢查結果顯示，有淋巴結轉(zhuǎn)移47例，無淋巴結轉(zhuǎn)移6例。常規(guī)HE檢查無淋巴結轉(zhuǎn)移病例中重新檢查出存在淋巴結微轉(zhuǎn)移9例，無淋巴結微轉(zhuǎn)移26例。

2.2 VEGFRs在不同胃癌組織中的表達

2.2.1 VEGFR1在胃癌組織中的表達 免疫組化結果發(fā)現(xiàn)VEGFR1在胃癌組織中平均光密度（OD值）為0.013。腫瘤浸潤深度（T）不同分期依次為：T1 0.009、T2 0.016、T3 0.014、T4 0.013，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。局部區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移（N）不同分期依次為：N0 0.014、N1 0.016、N2 0.012、N3 0.013，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 1。

2.2.2 VEGFR2在胃癌組織中的表達 免疫組化結果發(fā)現(xiàn)VEGFR2在胃癌組織中平均光密度（OD值）為0.025。腫瘤浸潤深度（T）不同分期依次為：T1 0.013、T2 0.022、T3 0.026、T4 0.026，差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。局部區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移（N） 不 同 分 期 依 次 為 ：N0 0.020、N1 0.023、N2 0.028、N3 0.027，差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。對于VEGFR2分別在不同腫瘤浸潤深度（T）、局部區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移（N）之間方差分析兩兩比較結果發(fā)現(xiàn)：T1與T2、T3、T4差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而 T2、T3、T4 之間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。N1 與 N2、N3、N4 差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；N2與N3、N4差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；N3與 N4差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 1。

2.2.3 VEGFR3在胃癌組織中的表達 免疫組化結果發(fā)現(xiàn)VEGFR3在胃癌組織中平均光密度（OD值）為0.018。腫瘤浸潤深度（T）不同分期依次為：T1 0.004、T2，0.012、T3 0.019、T4 0.021，差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。局部區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移（N） 不 同 分 期 依 次 為 ：N0 0.011、N1 0.015、N2 0.021、N3 0.025，差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。對于VEGFR3分別在不同腫瘤浸潤深度（T）、局部區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移（N）之間方差分析兩兩比較結果發(fā)現(xiàn)：T1與T2、T3、T4差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）； T2 與 T3、T4 差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；T3與T4差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且OD值逐漸遞增。N1與N2、N3、N4 差異均有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；N2 與 N3、N4 差異均有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）；N3與N4差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且 OD 值逐漸遞增。見表 1。

表1 血管內(nèi)皮生長因子受體在不同分期胃癌組織中平均光密度值的表達（）

表1 血管內(nèi)皮生長因子受體在不同分期胃癌組織中平均光密度值的表達（）

注：T：原發(fā)腫瘤。T1：腫瘤浸潤至固有膜或粘膜下層；T2：腫瘤浸潤至肌層或漿膜下層；T3：腫瘤穿透漿膜層，未侵及鄰近結構；T4：腫瘤直接侵及鄰近結構。N：局部區(qū)域淋巴結。N0：無區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移；N1：有1～6個區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移；N2：有7～15個區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移；N3：大于15個區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移

P值P值T1 T2 T3 T4 N0 N1 N2 N3分期 VEGFR1 P值0.009±0.001 0.016±0.003 0.014±0.009 0.013±0.008 0.014±0.007 0.016±0.007 0.012±0.006 0.013±0.007＞0.05＜0.05＜0.05＞0.05 VEGFR2 0.013±0.004 0.022±0.004 0.026±0.008 0.026±0.006 0.020±0.005 0.023±0.008 0.028±0.009 0.027±0.004＜0.05 VEGFR3 0.004±0.001 0.012±0.002 0.019±0.004 0.021±0.007 0.011±0.004 0.015±0.007 0.021±0.010 0.025±0.010＜0.05

3 討論

VEGFR屬于酪氨酸激酶Ⅰ型受體家族，具有酪氨酸激酶活性，它的表達不僅僅局限在血管內(nèi)皮細胞上，在腫瘤細胞表面也可以檢測到VEGF受體。它與配基VEGF結合后可促進腫瘤細胞生長、誘導淋巴管的形成，在腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移中起著極為重要的作用。本研究通過免疫組化技術對胃癌組織中的VEGF的三種受體VEGFR1、VEGFR2及VEGFR3的表達進行測定，以期分析這三種受體與胃癌分期及病理的關系。

目前已經(jīng)有VEGFR1在胃癌組織與正常組織之間差異表達的研究，而就其與胃癌的分期關系研究則鮮有報道。最近Mimori等[5]對810例胃癌患者骨髓和外周血采用實時相對定量PCR發(fā)現(xiàn)，胃癌的血行轉(zhuǎn)移需要VEGFR1的表達參與，其在胃癌組織中的高表達有利于胃癌的血行轉(zhuǎn)移；而通過本研究發(fā)現(xiàn)，VEGFR1在胃癌組織中的表達與腫瘤浸潤深度及淋巴結轉(zhuǎn)移不同之間均無相關性。本研究結果與Ding等[6]的研究結果在一定程度上吻合：研究顯示VEGFR1的激動表達更傾向于血行轉(zhuǎn)移，而與淋巴轉(zhuǎn)移關系可能不大。

VEGFR2在血管內(nèi)皮細胞及部分腫瘤細胞上特異性表達，對于腫瘤發(fā)生、發(fā)展更是起著重要的調(diào)節(jié)作用。VEGFR2基因敲除的小鼠不能產(chǎn)生分化良好的內(nèi)皮細胞和血管。已經(jīng)有不少研究表明VEGFR2在VEGF的信號轉(zhuǎn)導及血管內(nèi)皮生成上起主導作用。Brekken等[7]研究發(fā)現(xiàn)，用VEGF的單克隆抗體可以阻斷VEGF誘發(fā)的血管通透性增加和VEGF與VEGFR2的相互作用，卻不能阻斷VEGF與VEGFR1的相互作用，因此明確了VEGFR2在調(diào)節(jié)VEGF誘發(fā)的血管通透性增加和腫瘤血管生成中起主要作用。其后，Zeng等[8]也得到了同樣結論。這些研究提示VEGFR1和VEGFR2所引起的信號轉(zhuǎn)導級聯(lián)反應有所不同，VEGFR2有明顯促有絲分裂和化學趨化活性，在血管遇透性升高和血管生成過程中起主要作用。所以有些學者認為VEGFR2在腫瘤組織中的表達水平與腫瘤患者預后關系更為密切，但對于這一點目前仍然存在較大的爭議。如Deeaussin等[9]研究表明：VEGFR2的表達水平與癌組織中的血管生成水平呈正相關，與患者的生存期呈負相關。Harada等[10]認為VEGFR2可以作為結直腸癌患者的預測指標；而Delmotte等[11]進行的薈萃分析發(fā)現(xiàn)，VEGF可以作為預測患者的預后指標，但VEGFR2作為患者預后指標的證據(jù)不足。本研究結果顯示VEGFR2在胃癌組織中的表達與腫瘤浸潤深度及淋巴結轉(zhuǎn)移有關。

已有研究顯示，腫瘤新生淋巴管的生長主要是通過位于淋巴管內(nèi)皮細胞上的VEGFR3調(diào)節(jié)來實現(xiàn)，腫瘤細胞分泌的VEGFC特異性地與其受體VEGFR3結合，從而使腫瘤周圍的淋巴管胚芽向腫瘤組織內(nèi)部生長[12]。對于VEGFR3和胃癌淋巴結轉(zhuǎn)移的關系已有報道。如Choi等[13]研究顯示VEGFR3與胃癌淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關，提示VEGFR3是胃癌淋巴結轉(zhuǎn)移的潛在分子標志。Yonemura等[14]研究也發(fā)現(xiàn)胃癌中VEGFR3水平與陽性淋巴管數(shù)存在顯著相關性[15]。另外，Juttner等[16]研究還發(fā)現(xiàn)VEGFR3不僅與胃癌的淋巴轉(zhuǎn)移有關，而且還能預測胃癌患者的預后，是預后的一個生物學標記物。之前提到的Ding等[6]研究發(fā)現(xiàn)VEGFC高表達與淋巴結轉(zhuǎn)移有關，而VEGFC的高表達又進一步結合和激動VEGFR3。本研究對于VEGFR3的研究結果與國內(nèi)外研究基本一致，進一步證實了VEGFR3對于胃癌的演進和轉(zhuǎn)移起著重要的作用。另外本研究除了發(fā)現(xiàn)VEGFR3在胃癌組織中的表達與患者的浸潤深度、局部區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移相關外，還發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中的表達量隨著浸潤深度、局部區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移數(shù)的增加而逐漸遞增。提示VEGFR3在胃癌組織中的表達量可以作為疾病嚴重程度的一個量化指標，VEGFR3可以反映不同的浸潤深度和淋巴結轉(zhuǎn)移情況。

本研究通過使用免疫組化技術對VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3在胃癌組織細胞中的表達與分期關系的研究發(fā)現(xiàn)：在不同腫瘤浸潤深度及淋巴轉(zhuǎn)移程度的胃癌組織中VEGFR1的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而VEGFR2的表達差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），VEGFR3的表達差異也有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），并且在胃癌組織中VEGFR3的表達量隨著浸潤深度、局部區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移數(shù)的增加而逐漸遞增，這提示VEGFR3在胃癌組織中的表達量可以作為疾病嚴重程度的一個量化指標，VEGFR3可以反映不同的浸潤深度和淋巴結轉(zhuǎn)移情況。

總之，通過本研究發(fā)現(xiàn)，在不同腫瘤浸潤深度及淋巴轉(zhuǎn)移程度的胃癌組織中，VEGFR2的表達有差異性，VEGFR3的表達亦有差異性，且VEGFR3的表達隨著浸潤深度、局部區(qū)域淋巴結轉(zhuǎn)移數(shù)的增加而遞增，提示VEGFR3在胃癌組織中的表達量可以作為疾病嚴重程度的一個量化指標，為研究胃癌的治療新靶點提供了進一步的理論依據(jù)。

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