纈草提取物8-羥基松脂醇苷對Kv1.5鉀通道電流的影響*

方穎，段雪云，2，王宏飛，范恒，劉焱文

(1.湖北中醫(yī)藥大學湖北省中藥資源與中藥復方省部共建教育部重點實驗室，武漢 430065;2.湖北省中醫(yī)院藥學部，武漢 430065;3.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430022)

纈草(Valeriana officinalis L.)為敗醬科纈草屬植物，傳統(tǒng)醫(yī)學認為纈草有安心神、祛風濕、行氣血、鎮(zhèn)痛的功效;現(xiàn)代藥理研究表明，纈草提取物對由烏頭堿、哇巴因、腎上腺素等誘發(fā)的心律失常動物模型均有良好的對抗作用，延長動作電位時程和有效不應期，抑制心肌自律性［1］;能明顯對抗乙酰膽堿一氯化鈣誘發(fā)的小鼠心房顫動(房顫)和三氯甲烷誘發(fā)的小鼠心室顫動(室顫)，也能明顯對抗大鼠由結(jié)扎左冠狀動脈前降支誘發(fā)的早期缺血性心律失常［2］。

為了闡釋纈草的抗心律失常物質(zhì)基礎(chǔ)，本實驗室采用超臨界二氧化碳(CO2)萃取法和系統(tǒng)溶劑法，將纈草分為不同提取部位，然后以烏頭堿、三氯甲烷兩種誘導劑誘導心律失常的模型進行藥理實驗，確定纈草抗心律失常的主要活性部位［3-4］。在活性部位篩選的基礎(chǔ)上，采用色譜法，對主要活性部位的化學成分進行了初步分離，得到8-羥基松脂醇苷等十幾個單體化合物，以轉(zhuǎn)基因Kv1.5HEK293細胞為受試對象，采用膜片鉗全細胞記錄電流的方法對分離得到的化合物進行抗心律失常的作用篩選研究，旨在從細胞通道水平闡明其抗心律失常的作用機制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 倒置顯微鏡 OLYMPUS IX71(日本Olympus公司)，膜片鉗放大器(HEKAEPC-9 Germen)，PULSE 軟件(HEKA lambrecht Germen)，玻璃電極(南京六合泉水教學實驗儀器廠)，微電極拉制儀(P-97 Sutter Instrumentco，Norato，CA)，恒流泵 HL-2B(上海滬西分析儀器廠)。

1.2 試藥 纈草中分離的單體成分8-羥基松脂醇苷，其他試劑均為分析純。

1.3 細胞株 轉(zhuǎn)基因Kv1.5HEK293細胞由香港大學惠贈。

2 材料與方法

2.1 細胞培養(yǎng)與傳代 將細胞約3×105個置培養(yǎng)瓶中(25 cm)，加含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)達爾伯克改良必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco＇s modified minimal essential medium，DMEM)5mL，置37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞生長80% ～90%融合時，即可進行傳代。將磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、培養(yǎng)基、胰酶等液體在37℃水浴預熱。先棄去培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，再用PBS沖洗，后加入胰酶消化液約2.5mL，并輕柔搖動，使消化酶流遍所有細胞表面，在顯微鏡下觀察到貼壁生長的轉(zhuǎn)基因Kv1.5細胞回縮，胞體趨于變圓，細胞間縫隙變大時，立即終止消化，加入含血清的培養(yǎng)基約2.5mL，并用吸管反復吹打，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來成單個懸浮細胞，將細胞接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.2 細胞凍存與復蘇 細胞凍存時采用逐步降溫，依次在4℃冰箱放置0.5 h，－20℃冰箱放置0.5 h，然后放入－80℃冰箱24 h，即可轉(zhuǎn)移到液氮罐(－170℃)中長期保存;首先按細胞傳代方法將培養(yǎng)瓶中的細胞消化下來，轉(zhuǎn)移到離心管中，低速離心留取細胞沉淀。然后用預先配制的細胞凍存液重新懸起細胞，制成細胞懸液，分裝入凍存管中，注明細胞名稱和凍存日期。細胞復蘇時，從液氮罐中取出凍存管，迅速放入37℃水浴中，不停地輕輕搖動凍存管，使細胞可以盡快解凍。復蘇后24 h更換新鮮培養(yǎng)基。

2.3 溶液的配制 蒂羅德(Tyrode’s)液:氯化鈉137mmol·L-1、氯 化 鉀 5.4mmol·L-1、氯 化 鎂1.0mmol·L-1、氯化鈣 1.8mmol·L-1、磷酸二氫鈉0.33mmol·L-1、4-羥乙基呱嗪乙磺酸 10mmol·L-1、葡萄糖10mmol·L-1，用氫氧化鈉調(diào)pH至7.4;電極內(nèi)液:天門冬氨酸鉀 120mmol·L-1，氯化鉀20mmol·L-1，4-羥乙基哌嗪乙磺酸5mmol·L-1，氯化鎂 21mmol·L-1，ATP敏感性鉀(ATP-sensitive potassium，K-ATP)4mmol·L-1，乙二醇-雙-(2-氨基乙酸)四乙酸10mmol·L-1，磷酸肌酸二鈉 2mmol·L-1，用氫氧化鉀調(diào) pH到7.3;所有電極內(nèi)液均用孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾。供試品溶液:取適量從纈草中分離單體成分8-羥基松脂醇苷，臨用前溶于100%二甲亞砜中，配成相應的濃度，備用。

2.4 全細胞膜片鉗記錄方法 采用全細胞膜片鉗記錄方法，在電壓鉗制模式下記錄通道電流［5］。膜片鉗放大器通過A/D和D/A數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換器同計算機相連接，刺激信號及電壓、電流輸入信號的采集均由軟件PULSE控制。

實驗在室溫(22～24℃)下進行，吸取少許細胞懸液于0.5mL的灌流槽中，靜置5～10 min，待細胞貼壁后，用100% 氧氣飽和的細胞外液進行表面灌流5～10 min，流速2mL·min-1。在倒置顯微鏡下選擇邊緣清晰，表面光滑，立體感強，無收縮的細胞進行實驗。為了排除灌流對細胞電流的影響，整個實驗過程中采用細胞外液進行表面持續(xù)灌流，流速2mL·min-1。玻璃電極充灌電極內(nèi)液后入水電阻為1～2 ΜΩ。由于轉(zhuǎn)基因Kv1.5細胞體積較小，記錄通道電流時所用電極尖端開口較小，電極入液電阻2～3 ΜΩ。調(diào)節(jié)三維操縱器使電極尖端移向細胞表面，形成高阻封接，封接電阻＞1 GΩ。補償快電容并吸破細胞膜形成全細胞記錄模式。調(diào)節(jié)慢電容補償和串聯(lián)電阻補償70%～80%以減少瞬時充放電電流和鉗位誤差，然后在電壓鉗模式下記錄電流，保持電壓固定于－80 mV，階躍電壓10 mV，指令電位的步階范圍由－50 mV至60 mV，持續(xù)時間 300 ms，然后電壓保持在－50 mV，150 ms，分別記錄給予維拉帕米20 μmol·L-1前和5 min后穩(wěn)定的電流，該電流的后部分被抑制達70%以上，該電流激活較快，基本不失活，呈電壓依賴性，可被維拉帕米所阻斷，與人心房肌細胞IKur類似［6］，證實該電流系人Kv1.5通道的電流。

2.5 統(tǒng)計學方法 電生理資料由 Patch、Clampfit、Sigmaplot軟件處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，通過SPSS 10.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，用藥前后比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 8-羥基松脂醇苷對轉(zhuǎn)基因Kv1.5細胞電流時間依賴曲線的影響 采用上述實驗方法和實驗條件，分別用含 8-羥基松脂醇苷 0，10，30 μmol·L-1的電極外液灌流5 min，觀察電流變化，在不同濃度下電流減小，記錄不同濃度灌流前后，以及洗脫后的電流圖，見圖1。結(jié)果隨著給藥時間的推移，電流逐漸減小并漸趨穩(wěn)定，洗脫后緩慢恢復，并逐漸穩(wěn)定到最大值。見圖2。

3.2 8-羥基松脂醇苷對轉(zhuǎn)基因Kv1.5細胞電流單刺激曲線的作用 保持電壓固定于－50 mV，然后電壓保持在50 mV，持續(xù)300 ms的單刺激條件下所記錄的電流圖，與將分別用含8-羥基松脂醇苷0 μmol·L-1(對照組)，10 μmol·L-1，30 μmol·L-1的電極外液灌流5 min后，所記錄的電流進行曲線擬合，得出圖3。給藥10 μmol·L-1后的電流，較對照組明顯有所減小;給藥30 μmol·L-1后的電流，較對照組明顯減小，且對整個電流的抑制作用較10 μmol·L-1增強。抑制率分別為27.3% 和 35.6%(n=8，P＜0.05)。與串刺激下進行統(tǒng)計學所得結(jié)論一致。

圖1 不同濃度的8-羥基松脂醇苷對轉(zhuǎn)基因Kv1.5細胞的電流影響A 用藥前;B.10 μmol·L-1;C.30 μmol·L-1;D 洗脫后Fig.1 The effects of different concentrations of 8-hydroxy resin glycosides on the currents of the Kv1.5 HEK293 cellsA.before the treatment of 8-hydroxy resin glycosides;B.10 μmol·L-1;C.30 μmol·L-1;D.after the elution

圖2 8-羥基松脂醇苷對轉(zhuǎn)基因Kv1.5電流時間依賴曲線的影響A.用藥前;B.用藥后;C.洗脫后Fig.2 The effects of 8-hydroxy resin glycosides on the time dependency curve of the Kv1.5 HEK293 cellsA.before the treatment;B.after the treatment;C.after the elution

圖3 8-羥基松脂醇苷對轉(zhuǎn)基因Kv1.5電流單刺激曲線的作用Fig.3 The effects of 8-hydroxy resin glycosides on the stimulus curve of the Kv1.5 HEK293 cells

3.3 8-羥基松脂醇苷對轉(zhuǎn)基因Kv1.5細胞電流密度曲線的影響 保持電壓固定于－80 mV，階躍電壓10 mV，指令電位的步階范圍由－50 mV至60 mV，持續(xù)時間300 ms，然后電壓保持在－50 mV，持續(xù)150 ms，測定到Kv1.5通道電流，在指令電壓+60 mV時，用含8-羥基松脂醇苷10，30 μmol·L-1的電極外液灌流5 min后，使 Kv1.5 通道電流值從(148.3±13.0)PA/PF 分別降至(109.4±4.0)PA/PF 和(78.6±11.3)PA/PF，與對照組比較抑制率分別為28.5% 和37.1%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，n=6)。見圖4。

4 討論

實驗結(jié)果表明，8-羥基松脂醇苷對轉(zhuǎn)基因Kv1.5細胞電流有抑制作用，洗脫后電流基本恢復正常(略較用藥前偏低);不同濃度對轉(zhuǎn)基因Kv1.5細胞電流影響不同，濃度越高抑制越明顯。推測電流與濃度可能也呈現(xiàn)一定的依賴性，可能在一定范圍內(nèi)，藥物濃度越高，細胞電流抑制作用越強;并且沒有改變離子通道激活的特性。

基因Kv1.5細胞主要是電壓門控鉀通道(Kv1.5鉀通道)，其培養(yǎng)的細胞均為單鉀通道，阻止該通道會影響鉀電流，從而與心律失常密切相關(guān)。Kv1.5鉀通道電流是引起心肌細胞動作電位復極的主要電流及Ⅲ類抗心律失常藥的主要靶點。

本實驗選取轉(zhuǎn)基因Kv1.5 HEK293細胞進行觀察研究，HEK293細胞來源于人胚胎腎上皮細胞，也是常用的人心肌細胞離子通道基因體外表達系統(tǒng)。研究表明，HEK293細胞無內(nèi)源性 Kv1.5通道 mRNA的轉(zhuǎn)錄，其細胞膜上無 Kv1.5 通道表達［7-8］，作為Kv1.5 鉀通道體外細胞模型，可以排除內(nèi)源性 Kv1.5電流對實驗的干擾，超快速延遲整流鉀電流(ultrarapid delayed rectifier current，IKur)離子通道的分子基礎(chǔ)是Kv1.5鉀通道［9］，并且IKur是僅在心房肌發(fā)現(xiàn)的鉀通道電流，房顫時Ikur的變化非常重要，是潛在的心房選擇性抗房顫藥物的高敏靶點。由于HEK293是源于人的細胞系，以其為模型取得的實驗結(jié)果與人心肌細胞差異會更小。因此，藥物對轉(zhuǎn)基因Kv1.5鉀通道HEK293的電流有抑制作用，那么它可能有抗房顫作用。

從本實驗結(jié)果可以看出，8-羥基松脂醇苷對轉(zhuǎn)基因Kv1.5鉀通道電流有抑制作用，說明其可能通過抑制IKur，延長有效不應期，而達到抗房顫的作用，不致室性心律失常，有一定研究前景。當然人的心肌細胞主要有鈉、鉀、鈣3種離子通道，不同于本實驗只選用轉(zhuǎn)基因Kv1.5細胞單個鉀通道作研究，該藥對人體心肌細胞多個通道作用機制還有待于進一步進行。

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