陳 莉,孫紹發(fā),宋功武
(1.咸寧學(xué)院藥學(xué)院,湖北 咸寧 437100;2.湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,湖北 武漢 430062)
蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)一類最重要的生物大分子,藥物進(jìn)入人體后需要通過血漿的儲運(yùn)才能發(fā)生藥理作用。因此,研究以血清白蛋白為代表的蛋白質(zhì)與生物活性小分子間的相互作用,有助于認(rèn)識藥物的作用機(jī)制,了解藥物在體內(nèi)的運(yùn)輸、分布,也有助于對藥物的藥效和不良反應(yīng)進(jìn)行評估,具有重要的理論指導(dǎo)意義。
吡喃并噻吩并嘧啶酮衍生物是一類具有良好生物活性的雜環(huán)化合物,如抗菌、抗病毒[1,2]、抑制肥胖[3,4]、消炎鎮(zhèn)痛[5]、抗焦慮以及抗心律不齊[6]等。
作者采用熒光光譜法研究了不同溫度下3-對氯苯基-2-(四氫吡咯-1-基)-5,6,8-三氫吡喃并[3′,4′:4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮(PPTP)(圖1) 與牛血清白蛋白(BSA) 的相互作用,計(jì)算了二者之間相互作用的熱力學(xué)參數(shù)、結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù),確定了作用力類型,并采用同步熒光技術(shù)考察了PPTP對BSA構(gòu)象的影響。
圖1 PPTP的結(jié)構(gòu)
PPTP,自制[7]:m.p.234~235 ℃。IR(KBr),ν,cm-1:3054(=CH),1687(C=O),1582(C=C),1521(C=N),1492、1458(C=C),1221(C-N),1089(C-O-C)。1HNMR(300 MHz,CDCl3),δ,ppm:1.73(s,4H,2CH2),2.98(s,2H,CH2),3.06(t,4H,2CH2),3.96(t,2H,CH2),4.73(s,2H,CH2),7.26~7.45(m,4H,C6H4)。MS:m/z,%:387(100,[M+]),358(24),287(17),165(34),111(24),70(32)。
牛血清白蛋白(BSA,中國科學(xué)院化學(xué)研究所),BSA溶解在Tris-HCl(0.05 mol·L-1Tris+0.10 mol·L-1NaCl,pH=7.4) 緩沖溶液中,其它試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
F-4500型熒光分光光度計(jì)(帶恒溫系統(tǒng))、UV-2300型紫外可見分光光度計(jì),日本日立;PHS-3C型pH計(jì),江蘇江分;BS124S型電子分析天平,北京賽多利斯。
分別配制5.0×10-3mol·L-1的PPTP貯備液(DMF為溶劑)及不同溫度(T=298 K、302 K、306 K、310 K)下pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液。
在1 cm比色皿中分別加入2 mL 1×10-5mo1·L-1的BSA溶液和不同量的PPTP,得到不同物質(zhì)的量比的PPTP與BSA系列溶液。在λ=282 nm下激發(fā),激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm,繪制系列溶液在不同溫度下300~500 nm 的熒光光譜圖。
由于蛋白質(zhì)中色氨酸、酪氨酸的存在使其具有內(nèi)源熒光,當(dāng)激發(fā)波長為282 nm時(shí),BSA在366 nm附近有熒光發(fā)射峰。而以同樣激發(fā)波長激發(fā)各濃度PPTP溶液,在366 nm附近則沒有熒光,證明在366 nm附近PPTP不會產(chǎn)生與BSA相互干擾的熒光。圖2為PPTP對BSA熒光猝滅光譜。
c(BSA)=1×10-5mol·L-1;A→J,PPTP(×10-5mol·L-1):0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5
由圖2可知,隨著PPTP濃度的增大,BSA 的內(nèi)源熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅,且發(fā)射波長略有紅移。
BSA熒光猝滅的原因通常有動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動態(tài)猝滅是猝滅劑分子與熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)之間有能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移,生成瞬時(shí)的激發(fā)態(tài)復(fù)合物而引起的猝滅。動態(tài)猝滅的猝滅常數(shù)隨溫度升高而增大,其過程遵循Stern-Volmer方程[8]。
(1)
式中:F、F0分別是有、無猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度;Kq是雙分子猝滅過程速率常數(shù);KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù);τ0是無猝滅劑時(shí)生物大分子的平均壽命(生物大分子的平均壽命約為10-8s);cq為猝滅劑濃度。而KSV=Kqτ0,故可由猝滅曲線斜率求得猝滅常數(shù)。通常各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)為2.0×1010L·mol-1·s-1。
根據(jù)Stern-Volmer 方程,作不同溫度下(T=298 K、302 K、306 K和310 K)的[(F0/F)-1]~cq關(guān)系圖,如圖3所示。
圖3 不同溫度下,[(F0/F)-1]~cq關(guān)系
由圖3得到298 K、302 K、306 K和310 K時(shí)的猝滅速率常數(shù)Kq分別為3.631×1012L·mol-1·s-1、3.154×1012L·mol-1·s-1、2.899×1012L·mol-1·s-1、2.565×1012L·mol-1·s-1。顯然,4個(gè)溫度下的猝滅速率常數(shù)Kq都遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1,且隨著溫度的升高,Kq值減小。表明形成復(fù)合物所引起的靜態(tài)猝滅是引起B(yǎng)SA溶液體系熒光猝滅的主要原因。
運(yùn)用公式Lineweaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)關(guān)系(式2)[9]探討PPTP與BSA的靜態(tài)猝滅作用:
(2)
式中:KLB為靜態(tài)熒光猝滅結(jié)合常數(shù),用于描述靜態(tài)猝滅過程中生物大分子與猝滅劑的結(jié)合反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)的量效關(guān)系。
表1 不同溫度下PPTP與BSA結(jié)合的Lineweaver-Burk常數(shù)、相應(yīng)直線關(guān)系
根據(jù)Van′t Hoff方程,在溫度變化不大時(shí)可以近似認(rèn)為ΔHθ為一常數(shù),由結(jié)合常數(shù)KLB,求得ΔGθ、ΔHθ、ΔSθ,見表2。
表2 不同溫度下,PPTP與BSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)
活性小分子與生物大分子之間的相互作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力。根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變ΔHθ和熵變ΔSθ的相對大小,可以判斷活性小分子與蛋白質(zhì)之間的主要作用力類型[9]:ΔHθ>0、ΔSθ>0為疏水作用力;ΔHθ<0、ΔSθ<0為氫鍵和范德華力;ΔHθ≈0、ΔSθ>0為靜電引力。
從表2可以看出,PPTP與BSA的相互作用是自發(fā)的(ΔGθ<0);ΔHθ>0、ΔSθ>0,可以認(rèn)為,PPTP與BSA之間的作用力主要是熵增加驅(qū)動的疏水作用力。
靜態(tài)猝滅過程中,靜態(tài)猝滅熒光強(qiáng)度與猝滅劑的關(guān)系可由熒光-猝滅劑分子間的結(jié)合常數(shù)表達(dá)式導(dǎo)出[10]:
(3)
式中:Ka為猝滅劑與BSA之間的結(jié)合常數(shù);n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。
表3 不同溫度下的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)
由表3可知,不同溫度下、pH值為7.4時(shí),PPTP與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n均接近1,Ka大于10 000 L·mol-1,說明PPTP與BSA兩者間有較強(qiáng)結(jié)合作用,且形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。
Δλex=15 nm所得同步熒光光譜反映酪氨酸殘基的光譜特性;而Δλex=60 nm所得同步熒光光譜反映色氨酸殘基的光譜特性。采用同步熒光技術(shù),固定BSA的濃度,逐漸增加PPTP的濃度,記錄Δλex=15 nm 和Δλex=60 nm 時(shí)的同步熒光光譜,結(jié)果見圖4。
c(BSA)=1.0×10-5mol·L-1;A→J,PPTP(×10-5mol·L-1):0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5
由圖4可以看出,酪氨酸殘基同步熒光光譜(Δλex=15 nm)的最大發(fā)射波長基本不變,色氨酸殘基同步熒光光譜(Δλex=60 nm)的最大發(fā)射波長紅移,表明PPTP與BSA發(fā)生相互作用后,導(dǎo)致色氨酸近鄰區(qū)域環(huán)境的極性增大,使得處于BSA中疏水區(qū)域的色氨酸殘基更多地暴露于介質(zhì)溶液的親水區(qū),這與熒光光譜的分析結(jié)果一致。另外,BSA色氨酸殘基所處周圍環(huán)境由于小分子的插入引起局部構(gòu)象改變,也可能導(dǎo)致BSA構(gòu)象的變化。
采用熒光光譜法,研究了不同溫度下、pH值為7.4時(shí),3-對氯苯基-2-(四氫吡咯-1-基)-5,6,8-三氫吡喃并[3′,4′:4,5]噻吩并[2,3-d]嘧啶-4(3H)-酮(PPTP)與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用。結(jié)果表明,PPTP主要以靜態(tài)猝滅方式使BSA熒光強(qiáng)度顯著降低;PPTP與BSA之間的作用力主要為疏水作用力;PPTP與BSA之間有較強(qiáng)結(jié)合作用,且形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn);PPTP與BSA發(fā)生相互作用后,導(dǎo)致色氨酸近鄰區(qū)域環(huán)境的極性增大,使得處于BSA中疏水區(qū)域的色氨酸殘基更多地暴露于介質(zhì)溶液的親水區(qū),BSA色氨酸殘基所處周圍環(huán)境由于小分子的插入引起局部構(gòu)象改變,從而導(dǎo)致了BSA構(gòu)象的變化。
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