非水毛細管電泳內(nèi)標法測定麻黃中麻黃堿的含量

肖宇航 ，秦 群，荊照政

1.中南大學湘雅醫(yī)院藥劑科，湖南長沙 410008；2.中南大學湘雅醫(yī)院中心實驗室，湖南長沙 410008

麻黃堿（ephedrine）是中藥麻黃的主要有效成分，具有松弛支氣管平滑肌、擴張支氣管、收縮血管、升高血壓及興奮中樞等作用。麻黃堿的測定方法很多，除容量分析法外，還包括薄層掃描法[1]、高效液相色譜法[2-4]、氣相色譜法[5]、電位滴定法以及導(dǎo)數(shù)光譜[6]、雙波長[7]等各種紫外分光光度法。目前高效毛細管電泳法已廣泛應(yīng)用于中藥成分的分析[8]，相比以上所述分析方法，它具有分析周期短，柱子不易污染，消耗試劑少，費用低的優(yōu)點，特別適用于快速檢驗。目前也有毛細管電泳方法用于測定麻黃堿的報道[9-10]。本文采用非水毛細管電泳內(nèi)標法定量測定麻黃堿，選擇了合適的內(nèi)標和非水電泳液，優(yōu)選了儀器工作參數(shù)，簡化了樣本預(yù)處理操作，為麻黃堿的測定提供了一種簡便、快速、定量可靠的方法，可用于醫(yī)學研究樣品和藥材中麻黃堿的測定。

1 儀器與試藥

System P/ACE 5010型毛細管電泳儀紫外檢測器（Beckman 公司），未涂層熔融石英毛細管（47 cm×75 μm）（河北永年光導(dǎo)纖維廠），小型搖擺式中藥粉碎機（浙江溫嶺市奧力中藥機械有限公司），60目鋼篩（浙江上虞五四紗篩廠），TGL16型臺式高速冷凍離心沉淀機（湖南儀器儀表廠），VC130PB型超聲液體破碎儀（美國SONICS＆MATERIALS公司），WH-2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

麻黃堿標準品（SIGMA 公司，批號：Lot-17E6749），品紅（上海滬峰生化試劑有限公司，批號：061018-2），草麻黃（山西大同），甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 電泳緩沖液的制備 精密稱取1.1402 g醋酸銨和1.2305 g醋酸鈉，用甲醇溶解并精確定容至500 ml（pH 7.0），混勻后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 內(nèi)標溶液的制備 精確稱取10.0 mg品紅，置于10 ml容量瓶內(nèi)，用電泳緩沖液定容到10 ml（1 g/L），然后取0.5 ml置于10 ml容量瓶內(nèi)，用電泳緩沖液定容到10 ml，混勻密封，得濃度為0.05 g/L的內(nèi)標溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿標準物10.0 mg置于10 ml容量瓶內(nèi)，用電泳緩沖液定容（濃度為1 g/L），混勻后取1 ml于5 ml玻璃容量瓶內(nèi)，用電泳緩沖液定容到5 ml（濃度為 0.2 g/L），混勻密封，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.4 樣品溶液的制備 稱取草麻黃干燥草質(zhì)莖50 g于40℃烤12 h，然后粉碎成能過60目鋼篩的粉末，稱取100 mg粉末置于10 ml具塞玻璃管中，加入2 ml 1%HCl，40℃電熱恒溫水浴箱中浸泡12 h。每隔3 h超聲提取1 min（勿使溶液發(fā)熱），2000 r/min離心10 min，取1 ml上清液置1.5 ml EP管中，室溫放置至樣品液全干（約2 h）。精密量取1 ml電泳緩沖液置EP管內(nèi)，并置于微型旋渦混合儀上使沉淀充分溶解后，12000 r/min離心10 min， 取100 μl上清液置于 0.5 ml塑料離心管內(nèi)（麻黃堿含量大于0.2%的樣品，需要酌情稀釋樣品液），加入10 μl內(nèi)標溶液，混勻，裝樣進行電泳分析。

2.2 電泳條件

工作電壓為20 kV，壓力進樣為10 Pa×10 s，電泳方向從正極到負極，柱溫為25℃，檢測波長為210 nm；運行緩沖液30 mmol／L醋酸銨和醋酸鈉甲醇緩沖液（pH 7.0）；兩次運行之間，必需用0.1 mol/L的NaOH溶液沖洗柱子3 min，再用醋酸銨甲醇溶液沖洗柱子3 min。各類型非水溶液在使用之前均用0.45 μm微孔濾膜濾過。

在上述測定條件下，記錄麻黃堿標準品和麻黃樣品測定的NACE色譜圖。見圖1。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 取1 g/L麻黃堿對照品儲備液適量，置于1.5 ml塑料離心管內(nèi)，置于室溫至樣品液全干，用電泳緩沖液稀釋，分別制成濃度為200.000、100.000、50.000、25.000、12.500、6.250和3.125 mg/L的對照品溶液。各取100 μl對照品溶液，分別加入10 μl內(nèi)標溶液，混勻，進行標準曲線的測定。以標準物濃度（Y）對標準物峰高與內(nèi)標物峰高比值（X）進行回歸分析，得麻黃堿回歸方程：Y=0.02775X+0.00129，相關(guān)系數(shù)r=0.9940。

圖1 NACE色譜圖

2.3.2 最低檢出濃度試驗 取1 g/L的鹽酸麻黃堿對照品溶液適量，置于1.5 ml塑料離心管內(nèi)，置于室溫至樣品液全干，精密加入1 ml電泳緩沖液，置于微型旋渦混合儀上充分混勻，進樣。當檢測器顯示的OD210值穩(wěn)定后，啟動電泳儀，在麻黃堿快去峰時，提前10 s隨機記錄麻黃堿在保留時間（tR）里的信噪吸收（absorbace，AU）最大值，按信噪比（S/N）約等于3，測得麻黃堿最低檢出濃度為2 mg/L。

2.3.3 精密度試驗 取0.1 g/L的麻黃堿對照品溶液100 μl，加入10 μl內(nèi)標溶液，混勻，連續(xù)測定6次，測定結(jié)果顯示RSD為2.05%，表明儀器精密度良好。選用1個樣品，按樣品處理程序進行操作，處理6份分別測定，測定結(jié)果顯示，RSD為3.17%，表明本方法精密度良好。

2.3.4 加樣回收率試驗 分別選用含麻黃堿低和高的樣品（含量約為0.1%和0.5%），每一個樣品制成2份，每份取100 mg粉末置于10 ml玻璃管中，其中一份準確加入與樣品含量相當?shù)穆辄S堿對照品（即第一組加入0.1 g/L麻黃堿1 μl，第二組加入0.5 g/L麻黃堿1 μl，），將其作為已知標準值的試驗樣品。而另一份樣品作為空白對照樣品。分別按樣品處理程序進行操作，然后對4組單樣進行測定，每份單樣測定6次，結(jié)果顯示本方法測定麻黃堿的回收率為97.47%～101.85%。測定結(jié)果見表1。

2.4 陰性空白試驗

對麻黃堿的類似物鞣酸、黃酮苷、糊精和菊粉等按樣品處理程序進行分析，未發(fā)現(xiàn)類似麻黃堿的未知物對毛細管區(qū)帶電泳測定麻黃堿產(chǎn)生干擾。

表1 NACE測定麻黃堿回收試驗結(jié)果

2.5 麻黃堿含量測定

麻黃堿含量以重量百分比表示，麻黃堿含量=（A/B）×F/W×100%。其中，A為麻黃堿峰高，B為內(nèi)標物峰高，F(xiàn)為麻黃堿回歸方程中的斜率，W為1 ml樣品溶液里草麻黃的重量（mg）。經(jīng)測定，草麻黃中麻黃堿含量為0.83%。

3 討論

3.1 內(nèi)標物的選擇

非水毛細管電泳內(nèi)標法測定麻黃堿的關(guān)鍵，在于選擇合適的內(nèi)標物質(zhì)，使各種因素變化引起的誤差最小。內(nèi)標峰不僅要與所有樣品峰分開，而且與被測樣品峰靠得越近越好。本方法選擇品紅作為內(nèi)標，初步達到優(yōu)化內(nèi)標物的要求。

3.2 電泳緩沖液的選擇

用非水毛細管區(qū)帶電泳測定麻黃堿時，用0.1 mol/L的NaOH溶液沖洗柱子，能顯著提高靈敏度。在電泳緩沖液里加入醋酸鈉，能使基線更平穩(wěn)，另外電泳緩沖液里必須加入醋酸銨，否則檢測不到樣品峰。

3.3 電流的選擇

在相同條件下，非水系統(tǒng)電流遠小于水溶液系統(tǒng)，因此允許使用較高的運行電壓和較大的電解質(zhì)濃度，達到更加快速、高效分離的目的。但電泳時的電流過大會使基線不穩(wěn)定，甚至于斷電，可以稀釋緩沖液使電流降低。本文中的分析電流控制在60 μA，能得到平穩(wěn)的基線。

3.4 電壓的選擇

分離電壓越高，樣品的遷移時間越短，但分離效果不如電壓較低時好。分離電壓太低，樣品的遷移時間過長，電泳峰隨之展寬使得峰形劣化，定量誤差加大。經(jīng)過試驗比較和優(yōu)化，選擇10 kV作為分離電壓。

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