肝細胞癌中HBx蛋白與生存素蛋白表達的關(guān)系及其意義

陳 江，崔 彬，姜漢國

廣東省廉江市人民醫(yī)院腫瘤科，廣東廉江 524400

乙型肝炎病毒感染影響到全球近4億人口，是肝細胞癌（hepatic cellular cancer，HCC）最重要的獨立危險因素。乙型肝炎病毒是3.4 kb的DNA病毒，含有4個部分雙鏈的開放讀碼框，編碼C、S和X蛋白及病毒DNA聚合酶，其中X蛋白（HBx）已明確和腫瘤發(fā)生有關(guān)。X蛋白是一種多功能蛋白，通過一種未知的機制使細胞分裂及死亡發(fā)生調(diào)節(jié)障礙，HBx缺乏轉(zhuǎn)變活性，但可以使肝臟表達HBx的易感品系的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生肝細胞癌[1-2]。生存素是一種新近發(fā)現(xiàn)的在人類大部分腫瘤組織中表達的一種抗凋亡蛋白，其主要作用是凋亡抑制及細胞周期調(diào)節(jié)。本試驗通過免疫組織化學(xué)方法檢測二者在HCC組織的表達，探討其在HCC發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2000年2月～2010年5月我院外科手術(shù)切除的HCC標本58例，臨床和病理資料完整?；颊呔唇?jīng)過任何抗腫瘤治療，其中，男46例，女12例；年齡23～86歲，中位年齡60歲；Edmondson病理分級：1～2級 16例，3級以上 42例。47例AFP增高，伴有門靜脈癌栓18例，腹腔淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移9例。所有組織標本均經(jīng)10%甲醛固定，石臘包埋，5 μm連續(xù)切片。

1.2 方法與試劑

HBx蛋白抗體和人生存素（FL-142）單抗及S-P試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組化采用S-P方法，操作步驟如下：石蠟切片脫蠟至水；3%H2O2室溫孵育5～10 min；微波抗原修復(fù)；正常山羊血清封閉，室溫15 min，滴加p53和生存素抗原工作液，冰箱內(nèi)4℃過夜；PBS沖洗，滴加第二代生物素，標記二抗工作液，室溫20 min；PBS沖洗，滴加第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫20 min；PBS沖洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，封片。已知的肝癌HBx及生存素陽性切片為陽性對照，磷酸鹽緩沖液（PBS）作為空白對照。

1.3 結(jié)果判斷

觀察每張切片至少有5個具有代表性的高倍視野，不少于1000個細胞，HBx和生存素均以胞質(zhì)或胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性染色，這樣的細胞大于或等于100個為陽性，對免疫組化結(jié)果進行評估。HBx陽性表達定位于細胞核 （圖1），生存素陽性表達定位于細胞質(zhì)（圖2），均呈棕黃色。

圖1 HBx陽性表達（S-P×200）

圖2 生存素陽性表達（S-P×200）

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料用百分率表示，采用χ2檢驗，相關(guān)分析采用spearman等級相關(guān)系數(shù)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細胞癌組織中乙型肝炎病毒X蛋白及生存素的表達及關(guān)系

HBx的陽性表達信號多為核型，生存素的陽性表達定位于細胞質(zhì)，均呈黃色顆粒。HBx的陽性率為46.6%（27/58），生存素的陽性率為69.0%（40/58），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=5.365，P＜0.05）；HBx陽性的 HCC組織生存素的陽性率為 70.4%（19/27），HBx陰性的HCC組織生存素的陽性率為 27.5%（11/40），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.673，P＜0.05）。 等級相關(guān)分析表明，HCC組織中HBx和生存素的表達呈正相關(guān)（r=0.413，P＜0.05）。 見表 1。

2.2 乙型肝炎病毒X蛋白及生存素表達與肝細胞癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

HBx在HCC組織中的陽性表達率與Edmondson分級相關(guān)（r=0.4327，P＜0.05）；Ⅰ～Ⅱ級陽性率為 18.8%，≥Ⅲ級陽性率為57.1%。有門靜脈癌栓者的陽性率（66.7%）明顯高于無門靜脈癌栓者（37.5%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；AFP 增高者HBx的陽性率明顯高于正常者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；HBx 的表達與有無轉(zhuǎn)移無關(guān)（r=0.2354，P＞0.05）。生存素在病理分級差、有門脈癌栓及轉(zhuǎn)移和伴有AFP高的HCC組織中的陽性表達率明顯高于病理分級好、無門脈癌栓及轉(zhuǎn)移和不伴有AFP高的HCC組織的陽性表達率。見表1。

表1 肝細胞癌組織中乙型肝炎病毒X蛋白及生存素的表達及關(guān)系[n（%）]

3 討論

嗜肝病毒科的來源于哺乳動物的正嗜肝DNA病毒具有表達X蛋白的功能，X蛋白的結(jié)構(gòu)與宿主細胞DNA糖基化酶功能結(jié)構(gòu)域具有同源相似特點，而DNA糖基化酶是DNA復(fù)制時堿基切除修復(fù)的主要酶[3]。在乙型肝炎病毒誘發(fā)的肝細胞癌的過程中X基因經(jīng)常與肝細胞DNA整合，HBX促進細胞周期進程，使抑制細胞生長的調(diào)節(jié)因子失活，與p53及其他腫瘤抑制因子及衰老相關(guān)因子結(jié)合并抑制其功能。近年研究表明，HBX調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)甲基酶轉(zhuǎn)錄，使DNA局部甲基化導(dǎo)致抑癌基因沉默或者使DNA全部甲基化造成染色體不穩(wěn)定，從而在肝癌發(fā)生中起作用?？沟蛲鲎饔门cp53抑制有關(guān)，促進凋亡作用機制不明。HBX能夠增加端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的表達及端粒酶的活性從而延長肝細胞壽命有利于惡變，羥基末端去除的HBX失去了抑制細胞增殖及促進凋亡性能，增強了其調(diào)控癌基因的功能，使胰島素樣生長因子調(diào)節(jié)異常，促進增殖及凋亡抑制，使細胞生長失控[4]。

生存素是人類基因組中的腫瘤特異性基因，正常的成人組織罕有表達，在大部分人類腫瘤中高表達。生存素含有特征性的鋅指結(jié)構(gòu)稱為BIR結(jié)構(gòu)域，屬于凋亡抑制蛋白（IPA）家族成員之一，其他凋亡抑制蛋白家族成員的凋亡抑制是直接與細胞內(nèi)半胱天冬酶結(jié)合抑制其活性，生存素不能直接與半胱天冬酶結(jié)合，乙肝病毒X蛋白相互作用蛋白（HBXIP）作為輔助因子在生存素引發(fā)的凋亡抑制起一定作用[5]。HBX蛋白的C末端與HBXIP結(jié)合再與生存素結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物可以與前半胱天冬酶-9結(jié)合，從而阻止其募集到凋亡前酶活化因子（Apaf-1）上，使生存素借助細胞色素C介導(dǎo)的凋亡途徑選擇性地抑制半胱天冬酶的蛋白酶活性，在細胞凋亡中發(fā)揮橋梁作用[6]。

本研究顯示，HBX上調(diào)生存素的表達，提示肝細胞癌發(fā)生凋亡抑制。另外，HBx蛋白可與p53蛋白結(jié)合并使其失活，而生存素基因是一個被野生型p53基因抑制的基因[7]，HBx蛋白上調(diào)生存素在肝細胞癌中的表達形成凋亡抵抗，本研究結(jié)果證明了這一點。病理分級分化差，伴有門脈癌栓及AFP增高有轉(zhuǎn)移者HBx及生存素表達上調(diào)，表明HBx及生存素表達與肝細胞癌的惡性程度疾病進展有關(guān)。HBx上調(diào)生存素表達使細胞周期調(diào)控失常，凋亡障礙增殖過度，可能是乙型肝炎病毒感染引起肝細胞癌原因之一。

[1]Wen Y,Golubkov VS,Strongin AY,et al.Interaction of hepatitis B viral oncoprotein with cellular target HBXIP dysregulates centrosome dynamics and mitotic spindle formation[J].J Biol Chem,2008,283(5):2793-2803.

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