白芷根中香豆素類成分的組織化學(xué)定位研究

蘭志瓊 ，盧先明 ，陳繼蘭，周 毅，馬逾英，胡友福

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川 成都 611137；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611137

組織化學(xué)（histochemistry）是建立在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)之上的邊緣科學(xué)范疇，是研究細(xì)胞和組織中的化學(xué)組成、定位與定量以及代謝狀態(tài)的科學(xué)[1]。組織化學(xué)的不斷發(fā)展，為我們開展中藥活性成分的產(chǎn)生、分布和積累規(guī)律提供了新穎、科學(xué)、可靠的方法。

白芷始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為常用的解表、止痛藥?，F(xiàn)代研究結(jié)果表明，香豆素類化合物為白芷的主要有效成分之一。本文利用香豆素類成分的自發(fā)熒光性質(zhì)，首次引入植物冰凍切片、熒光顯微技術(shù)等組織化學(xué)研究方法，確定香豆素類成分在白芷根中的積累部位，為進(jìn)一步揭示白芷活性成分香豆素類及其積累規(guī)律與白芷組織結(jié)構(gòu)及發(fā)育的關(guān)系奠定一定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

冰凍切片機(jī)（CM-1900，Leica），電控型倒置熒光顯微鏡（DMIRE2，Leica），顯微攝影系統(tǒng)（DFC300，Laica）。

OCT包埋劑 （北京海德創(chuàng)業(yè)生物科技有限公司，批號：4583，118 ml/瓶），歐前胡素（寶雞辰光生物有限公司，批號：482-44-0。準(zhǔn)確稱取歐前胡素0.1 mg，用甲醇溶解在10 ml量瓶中，定容即得歐前胡素溶液），無水乙醇、95%乙醇、甲醇、冰醋酸、福爾馬林、丙三醇均為分析純。

白芷根新鮮材料取自成都中醫(yī)藥大學(xué)（溫江校區(qū)）藥用植物園的栽培植物，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)馬逾英教授鑒定為傘形科植物杭白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.）Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss.）Shan et Yuan。 2011年 5月分3次取兩年生白芷根中部新鮮材料做正式實驗。

2 方法與結(jié)果

2.1 白芷根冰凍切片的制作

冰凍切片是利用低溫使組織迅速凍結(jié)達(dá)到一定硬度進(jìn)行切片的一種方法[2]。該切片能更好地保存細(xì)胞內(nèi)生物分子的活性，在組織化學(xué)、細(xì)胞免疫化學(xué)和原位雜交等研究中顯示出獨特作用。在動物和人體的研究中已被廣泛應(yīng)用，但在植物上的應(yīng)用相對較少，在中藥上的應(yīng)用更是鮮見。因為與動物細(xì)胞相比，植物細(xì)胞有細(xì)胞壁和大液泡，含水量遠(yuǎn)大于相同體積的動物細(xì)胞，冷凍后的植物樣品比動物樣品硬度大，難以切片和保持植物組織結(jié)構(gòu)的完整性。而且，對于一棵完整的植物，不同部位的質(zhì)地及含水量存在巨大差異，如何改進(jìn)冰凍切片技術(shù)，使之適用于不同質(zhì)地的材料，是冰凍切片技術(shù)在植物學(xué)研究應(yīng)用中所面臨的一個重要問題。

首次開展白芷根橫切面的冰凍切片制作技術(shù)的系統(tǒng)研究，經(jīng)過大量預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)影響白芷根冰凍切片質(zhì)量的主要因素包括保護(hù)劑、包埋劑、切片厚度。故采用單因素實驗方法綜合分析，篩選白芷根冰凍切片的最佳制作技術(shù)。具體實驗內(nèi)容見表 1～3。

表1 不同保護(hù)劑對白芷根冰凍切片質(zhì)量的影響

表2 不同包埋劑對白芷根冰凍切片質(zhì)量的影響

表3 不同切片厚度對白芷根冰凍切片質(zhì)量的影響

2.2 白芷根中香豆素類成分的自發(fā)熒光實驗[3-4]

香豆素是鄰羥基桂皮酸的內(nèi)酯，易溶于甲醇、乙醇、氯仿和乙醚；在紫外線照射下易產(chǎn)生藍(lán)色熒光，且新鮮材料的熒光性很少變化[5]。

2.2.1 白芷根的熒光顯微鏡觀察 將切好的白芷根材料置于載玻片上，稀甘油制片，置熒光顯微鏡下，用紫外光進(jìn)行激發(fā)，觀察并照相。

2.2.2 同步陽性對照 取歐前胡素標(biāo)準(zhǔn)品試液于載玻片上，稀甘油制片，置熒光顯微鏡下，用紫外光進(jìn)行激發(fā)，觀察并照相。

2.2.3 同步陰性對照 將切好的白芷根材料置于載玻片上，滴加70%乙醇配制的FAA固定液，固定大約30 min，依次經(jīng)過85%、95%、100%乙醇處理后，用稀甘油制成臨時制片后，置熒光顯微鏡下，用紫外光進(jìn)行激發(fā)，觀察并照相。

2.3 實驗結(jié)果

2.3.1 白芷根冰凍切片的制作 通過單因素考察實驗，即在不同條件下進(jìn)行切片，然后在光學(xué)顯微鏡下對各組切片進(jìn)行觀察、比較并照相，結(jié)果顯示，以15%的甘油作為保護(hù)劑，OCT為包埋劑，切片厚度為30 μm的白芷根冰凍切片效果最佳。根據(jù)以上結(jié)果，結(jié)合植物冰凍切片基本操作步驟，得到白芷根冰凍切片的制作技術(shù)：取白芷根中部新鮮材料，切成約0.5 cm的小段，立即投入裝有15%甘油保護(hù)劑的安瓿瓶中，將其置于玻璃真空干燥器中，使用旋片式真空泵抽氣20 min，使材料空腔完全被保護(hù)劑所填充。然后取出，用冰凍切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為20～30 μm，用稀甘油制成臨時制片后，立即在熒光顯微鏡下觀察。

2.3.2 白芷根的熒光顯微鏡觀察 白芷根橫切面從外到內(nèi)結(jié)構(gòu)依次是：木栓層、栓內(nèi)層、韌皮部、形成層、木質(zhì)部。在紫外線的激發(fā)下，根的木栓層、木質(zhì)部及栓內(nèi)層、韌皮部中的分泌組織處均有強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光出現(xiàn)（圖1～2）。

圖1 白芷根橫切面（熒光顯微鏡下，示木栓層、韌皮部）

圖2 白芷根橫切面（熒光顯微鏡下，示韌皮部、木質(zhì)部）

2.3.3 同步陽性對照 在紫外線的激發(fā)下，歐前胡素有強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光出現(xiàn)（圖3）。

圖3 歐前胡素（熒光顯微鏡下）

圖4 白芷根橫切面（熒光顯微鏡下，經(jīng)乙醇處理過）

2.3.4 同步陰性對照 經(jīng)過乙醇處理后的白芷根冰凍切片，在紫外線的激發(fā)下，其木栓層和木質(zhì)部仍有熒光產(chǎn)生，而分泌組織處的熒光消失（圖4）。

3 討論

本實驗為首次系統(tǒng)開展白芷根冰凍切片制作技術(shù)研究，篩選出白芷根冰凍切片的最佳制作技術(shù)；首次引入組織化學(xué)研究方法，通過科學(xué)實驗證實在白芷根中，香豆素類成分僅分布在分泌組織中。該研究為進(jìn)一步揭示白芷活性成分香豆素類及其積累規(guī)律與白芷內(nèi)部結(jié)構(gòu)及發(fā)育的關(guān)系奠定一定基礎(chǔ)。

本研究僅對白芷根中活性成分之一香豆素類成分進(jìn)行了組織化學(xué)定位研究，有待引入現(xiàn)代先進(jìn)技術(shù)如激光共聚焦顯微鏡技術(shù)開展相對定量研究，并可開展白芷藥材另一活性成分揮發(fā)油的組織化學(xué)研究，以期為進(jìn)一步研究中藥白芷活性成分及其積累規(guī)律與其內(nèi)部結(jié)構(gòu)及發(fā)育的關(guān)系奠定扎實的基礎(chǔ)。

[1]鄭艷,徐珞珊,王崢濤.組織化學(xué)在藥用植物研究中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐,2007,22(3):61-63.

[2]謝佩松,徐中根,韋存虛.冰凍切片技術(shù)在植物顯微結(jié)構(gòu)和組織化學(xué)中的應(yīng)用[J].生物學(xué)雜志,2009,6(3):72.

[3]辛華,丁雨龍.珊瑚菜中香豆素的組織化學(xué)定位[J].廣西植物,2008,28(6):847-850.

[4]秦玲,劉文哲.補(bǔ)骨脂中呋喃香豆素類物質(zhì)的積累規(guī)律及組織定位[J].武漢植物學(xué)研究,2007,25(4):360-365.

[5]He JL,Yang KR,Li XG.The Principle of Apparatus Analysis[M].Beijing:Science Press,2002:17-42.