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      小干擾垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子-1對大鼠垂體生長激素腫瘤細胞侵襲行為的影響

      2011-07-27 09:02:10范月超李錦曉李中林縱振坤苗發(fā)安謝滿意
      中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2011年36期
      關(guān)鍵詞:垂體瘤小室培養(yǎng)箱

      范月超,張 慧,李錦曉,李中林,縱振坤,陳 晨,馮 力,苗發(fā)安,謝滿意

      徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外二科,江蘇 徐州 221002

      垂體生長激素腺瘤是內(nèi)分泌癥狀活躍的一種侵襲性垂體瘤,生長激素(CH)過度分泌,被視為惡性的內(nèi)分泌腫瘤,它可以造成全身各系統(tǒng)的損害并危及生命,雖然手術(shù)可以明顯改善患者的臨床癥狀,但術(shù)后患者的內(nèi)分泌生化指標不令人滿意,復(fù)發(fā)率高,因而無法達到生物學(xué)治愈。研究表明[1-2],垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子-1(pituitary-specific transcription factor-1,pit-1)是重要的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子,對生長激素基因表達有著重要的調(diào)控作用,不僅可以激活GH基因的表達,而且能夠調(diào)控細胞生存和增生所必須的其他相關(guān)基因。Pit-1基因在垂體腺瘤的發(fā)生及侵襲行為中扮演什么樣的角色,目前尚無相關(guān)研究。本實驗通過設(shè)計pit-1 siRNA轉(zhuǎn)染大鼠GH3型垂體瘤細胞,探討pit-1對垂體腺瘤生物學(xué)特性的影響。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      大鼠垂體瘤細胞購于美國ATCC細胞庫,F(xiàn)-12k營養(yǎng)富集培養(yǎng)基(美國Gibco公司),馬血清(美國Gibco公司),胎牛血清 (杭州四季青 ),siRNA oligo (Gene Pharma),lipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司),RT-PCR (大連寶生物)。P44/42MAPK 一抗(碧云天),Boyden小室(Millipore公司),纖維連接蛋白、Matrigel膠(BD 公司)。

      1.2 方法

      1.2.1 細胞培養(yǎng) 將GH3細胞用含15%馬血清+2.5%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代(2~3 次/周)。

      1.2.2 RNA干擾 針對大鼠pit-1基因的三條siRNA oligo由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成并測序鑒定,序列如下:Pit1-rat-602:5′-GGCUCCGAAUUCAGUCAAATT-3′;Pit1-rat-138:5′-CCUCGGC-UGAUACCUUUAUTT-3′;Pit1-rat-262:5′-GCGACAGGACUUCAUUAUUTT-3′。將狀態(tài)良好的細胞接種于6孔板,在24 h內(nèi)使細胞匯合達到90%,然后應(yīng)用lipofectamineTM2000,按照說明書步驟進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后細胞放在CO2培養(yǎng)箱中37℃溫浴24~48 h后,提取細胞總RNA檢測pit-1干擾后的效果。

      1.2.3 RT-PCR分析pit-1 mRNA的表達 由Genbank檢索pit-1 mRNA序列,利用Primer3.0在線設(shè)計引物并經(jīng)BLAST檢驗,pit-1 引物正義鏈:5′-ATTCAGTCAAACAACCATCTGC-3′,反義鏈 5′-aAAGTGTCTCTCCAAA-GCATCC-3′,產(chǎn)物長度 273 bp。 β-actin基因上游引物:5′-CGTTGACATCCGTAAAA-3′, 下游引物:5′-AGCCACCAATCCACACAG-3′,擴增產(chǎn)物大小173 bp,均由invitrogen公司合成。

      1.2.4 提取總RNA 利用oligo(dT)20引物和SuperScript RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,進行PCR擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件:94℃3 min,94℃ 30 s,58℃ 30 s,72℃ 1 min,30 個循環(huán),72℃延伸10 min。PCR引物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,溴化乙啶染色后,用自動電泳凝膠掃描分析系統(tǒng)采集并分析電泳目的條帶的積分密度值(integrated density value,IDV),將 pit-1 IDV/βactinIDV做為其mRNA水平的相對值,每次實驗至少重復(fù)3次。

      1.2.5 Boyden小室分析pit-1 siRNA對腫瘤細胞侵襲力和趨化作用的影響 取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板內(nèi),每孔3×105/ml,貼壁后,轉(zhuǎn)染,設(shè)空白對照組,陰性對照組及轉(zhuǎn)染組。

      1.2.6 Boyden小室的制備 細胞培養(yǎng)池的多孔PET膜直徑為 6.5 mm, 孔徑 8.0 μm,4℃條件下將1∶3稀釋后基質(zhì)凝膠(Matrigel Matrix,Becton Dickison Labware產(chǎn)品) 鋪于小室細胞培養(yǎng)池的 PET 內(nèi)表面,30 μl/孔,放入培養(yǎng)箱,37℃過夜。重懸細胞以不含血清的培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1.5×106/ml,24孔板加入含15%馬血清+2.5%胎牛血清的培養(yǎng)基500 μl。5%CO2,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。

      1.2.7 細胞固定、染色和侵襲性的計算 取出Boyden小室用PBS洗2遍,然后將PET的下表面浸泡于70%甲醛中,室溫固定30 min,風干,結(jié)晶紫染色10 min,用棉簽擦去上表面細胞,顯微鏡高倍鏡下計數(shù)PET膜下面的細胞數(shù)(圖2),每個樣本計數(shù)5個視野,取平均數(shù)。

      1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

      采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用t檢驗、校正的t檢驗,計數(shù)資料采用Fisher確切概率法,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 Pit-1 siRNA干擾效果的檢測

      針對pit-1基因設(shè)計三條高特異性siRNA oligo,分別為si138、si262和si602,并通過RT-PCR檢測三條小干擾在GH3垂體腺瘤細胞中對pit-1的敲除效果(圖1)。結(jié)果顯示:未轉(zhuǎn)染和pit-1 siRNA轉(zhuǎn)染GH3細胞均可檢測到pit-1 mRNA的表達,但兩者比較,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在GH3垂體腺瘤細胞中三條小干擾的敲除效果均在70%~80%。表明三條siRNA片段均能有效抑制GH3細胞內(nèi)pit-1的表達,實現(xiàn)其基因沉默效應(yīng)。

      2.2 pit-1 siRNA對腫瘤細胞侵襲力和趨化作用的影響

      轉(zhuǎn)染組、陰性對照組兩組細胞的侵襲力影響:每組分別取4個視野取其均數(shù),結(jié)果顯示陰性對照組細胞通過Boyden小室PET膜的數(shù)量明顯多于轉(zhuǎn)染組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見圖 2。

      圖1 pit-1 siRNA轉(zhuǎn)染GH3細胞24 h后各組細胞pit-1 mRNA的表達水平

      圖2 利用Boyden小室測定pit-1 siRNA對GH3細胞侵襲力作用的影響

      3 討論

      垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子pit-1編碼POU結(jié)構(gòu)域 (PITOCT-UNC domain)中的pit-1蛋白,包含1個POU特異性區(qū)域(POU-specific domain,poU-SD)和 1個 POU 同源性區(qū)域(Pou-homoeodomain,POU-HD),pit-1 基因在人類位于第 3號染色體,全長43 kb,由6個外顯子和5個內(nèi)含子組成[3]。有研究發(fā)現(xiàn)[4-5],pit-1有促進垂體細胞增殖的作用,對垂體腫瘤細胞生長起重要作用。許多垂體功能低下的疾病也被認為與pit-1的缺失有關(guān)[6]。而關(guān)于小干擾技術(shù)阻斷pit-1的表達對垂體瘤細胞侵襲作用的影響,相關(guān)研究很少。

      本實驗設(shè)計針對pit-1的siRNA,應(yīng)用脂質(zhì)體(lipofectin2000)轉(zhuǎn)染pit-1的siRNA進入GH3腺瘤細胞,通過RT-PCR檢驗pit-1基因的干擾效果,以探討pit-1基因在GH3腺瘤中的作用。結(jié)果未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染pit-1 siRNA的GH3細胞均可檢測到pit-1mRNA表達,但兩者比較,差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在GH3垂體腺瘤細胞中三條小干擾的敲除效果均在70%~80%。表明三條siRNA片段均能有效抑制GH3細胞內(nèi)pit-1 mRNA的表達,實現(xiàn)其基因沉默效應(yīng)。制備Boyden小室測定pit-1 siRNA對腫瘤細胞侵襲力和趨化作用的影響,結(jié)果表明陰性對照組細胞通過Boyden小室PET膜的數(shù)量明顯多于轉(zhuǎn)染組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。結(jié)果證明:干擾pit-1基因?qū)H3腺瘤的侵襲性有重要的抑制作用。

      以pit-1為靶點治療垂體腺瘤,目前國內(nèi)尚鮮見相關(guān)研究。通過本實驗證明:pit-1基因在GH腺瘤的侵襲性方面起著重要作用。通過反義技術(shù)可以高效、專一地抑制pit-1的表達,為侵襲性垂體腫瘤的治療提供了一條有益途徑。

      [1]Davis SW,Potok MA,Brinkmeier ML,et al.Genetics,gene expression and bioinformatics of the pituitary gland[J].Horm Res,2009,71(2):101-115.

      [2]Chesnokova V,Melemed S.Pituitary tumour-transforming gene(PTTG)and pituitary senescence[J].Horm Res,2009,71(2):82-87.

      [3]Kagami Y,Okimura Y,Kondoh T,et al.Expression of mPOU protein in the human pituitary adenomas[J].Kobe J Med Sei,2003,49(5-6):117-222.

      [4]范月超,雷霆,舒凱,等.垂體特異轉(zhuǎn)錄因子pit-1在垂體瘤中的表達及意義的實驗研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2006,16(3):858-865.

      [5]GrooP L,Segerlantz M,Bramnert M.Insulin sensitivity in adults with growth hormone deficiency and effect of growth hormone treatment[J].Horm Res,2005,64(3):45-50.

      [6]Kobayashil,Oka H,Naritaka H,et al.Expression of Pit-1 and growth hormone-releasing hormone receptor mRNA in human pituitary adenomas:differeneeamongfunctioning,silent,andothernonfunetioningadenomas[J].Endocr Pathol,2002,13(2):83-98.

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