靜電紡聚乳酸－乙醇酸·蛋殼膜蛋白纖維膜體外降解性能的研究

劉 更，段嫄嫄，賈 駿，延 衛(wèi)，靳海立

(陜西 西安:1.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院，710032;2.西安交通大學(xué)能動(dòng)學(xué)院，710049)

牙周引導(dǎo)組織再生(guided tissue regeneration，GTR)是利用屏障膜材料的機(jī)械阻隔作用來隔絕牙齦上皮細(xì)胞及結(jié)締組織長(zhǎng)入缺損區(qū)，創(chuàng)造一個(gè)利于牙周韌帶細(xì)胞遷移、分化、增殖的空間，重新形成牙骨質(zhì)、牙槽骨的一種再生技術(shù)。在GTR術(shù)中膜材料最為關(guān)鍵，按其性質(zhì)分為不可吸收性和可吸收性兩種。不可吸收性膜需二次手術(shù)取出，會(huì)對(duì)牙齦組織造成損傷;而可吸收性膜由于能夠自行降解，不需二次手術(shù)，是GTR膜開發(fā)、研究的方向。但可吸收性GTR膜在機(jī)體內(nèi)由于發(fā)生水合作用、水解或酶解反應(yīng)，使其形貌、結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能等發(fā)生改變，因此理想的可吸收性膜材料必須具備一定的空間維持能力，以及良好的生物相容性和合適的力學(xué)強(qiáng)度，而且降解速度應(yīng)與組織愈合時(shí)間相平衡，降解產(chǎn)物在機(jī)體內(nèi)無不良反應(yīng)［1］。

目前各種生物相容性良好的可降解高分子廣泛應(yīng)用于可吸收性GTR膜材料的研究，其中常用的聚乳酸 －乙醇酸(poly－lactide－co－glycolideacid，PLGA)雖然具有強(qiáng)度高［2］、可降解、易加工成型、可紡性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但作為GTR膜材料，在生物相容性及生物活性方面同天然高分子還有一定差距，親水性及對(duì)細(xì)胞的誘導(dǎo)性仍需進(jìn)一步提高，而且容易在降解過程中引起局部pH值下降導(dǎo)致無菌性炎癥［3］。從雞蛋殼膜中提取的可溶性蛋殼膜蛋白［3］(soluble eggshell membrane protein，SEP)雖然能夠支持NIH3T3細(xì)胞的粘附、生長(zhǎng)，且具有與Ⅰ型膠原幾乎相同的生物相容性［4］，但其可紡性差，無法單獨(dú)電紡，而且纖維機(jī)械強(qiáng)度低，生物降解速度較快［5］。鑒于以上原因，本研究采用靜電紡絲技術(shù)將親水性較好的SEP加入到機(jī)械性能較強(qiáng)的PLGA中共混電紡，制備PLGA·SEP納米纖維膜，再根據(jù)可降解性GTR屏障膜必須在降解6周時(shí)保持有效性能［6］的相關(guān)研究提示，觀察其在模擬體液(SBF，pH=7.4)中降解6周時(shí)，其形貌、結(jié)構(gòu)、力學(xué)強(qiáng)度變化是否在允許的范圍內(nèi)，為其作為GTR材料的后續(xù)應(yīng)用研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

PLGA 相對(duì)分子量 1×105，LA ∶GA=80∶20，濟(jì)南岱罡生物材料有限公司);SEP(按照文獻(xiàn)［3］從雞蛋殼膜中提取);六氟異丙醇(HFIP，Sigma公司，美國(guó));BGG40－2高壓直流電源(北京機(jī)電研究所0～30 kV);0.0001精度電子天平(賽可隆公司，中國(guó));EZ Test桌上型試驗(yàn)機(jī)(島津公司，日本);掃描電鏡(S－4800，日立公司，日本);DTA·TG熱重分析儀(STA 409，Netzsch公司，德國(guó))。

1.2 PLGA·SEP纖維膜，PLGA纖維膜的制備

根據(jù)對(duì)PLGA和SEP電紡實(shí)驗(yàn)的前期研究，取PLGA∶SEP=70∶30(質(zhì)量比)的共混物和純PLGA分別溶于六氟異丙醇(HFIP)中，形成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%(重量/v)的溶液作為電紡液，在電壓17 kV，接收距離14 cm，流速0.4 mL/h的工藝參數(shù)下電紡5 h，制備PLGA－SEP共混電紡纖維膜、PLGA電紡纖維膜。

1.3 降解實(shí)驗(yàn)

將上述制備的PLGA·SEP、PLGA纖維膜真空干燥24 h后，分別裁剪成2 cm×2 cm(用于質(zhì)量測(cè)試、形貌觀察和熱重分析)、10 cm×10 cm(用于斷裂強(qiáng)度測(cè)試)，隨機(jī)分為降解0、2、4、6 周共4 組，每組4個(gè)樣本。除0周組外，其余各組均浸泡在37℃、pH=7.4的模擬體液中(simulated body fluid solution，SBF，各種離子濃度見表1)，并使纖維膜面積(cm2)∶SBF溶液體積(mL)=1∶2。每3 d換1次液，以保證模擬體液的活性。

表1 模擬體液與血漿中各種離子濃度比較 (mmol/L)

1.4 降解前后各指標(biāo)測(cè)試

1.4.1 降解前后質(zhì)量測(cè)量

用電子天平(1/10000)分別測(cè)量降解前(0周組)和降解2、4、6周組各樣本真空干燥后的質(zhì)量，并按下列公式計(jì)算各組樣本的失重率。

失重率=(m0－m1)/m0×100%(式中 m0為降解前的質(zhì)量，m1為降解后的質(zhì)量)

1.4.2 斷裂強(qiáng)度測(cè)試

將降解前(0周組)和降解2、4、6周組各樣本真空干燥后，裁剪成5 cm×0.5 cm的標(biāo)準(zhǔn)試樣，采用千分尺測(cè)量每個(gè)試樣的厚度(每個(gè)試樣隨機(jī)測(cè)量20個(gè)點(diǎn)，取均值)，然后將標(biāo)準(zhǔn)試樣置EZ－test小型臺(tái)式試驗(yàn)機(jī)的夾具上，試樣兩端用醫(yī)用橡皮膏固定，保證夾距恒定為30 mm，以5 mm/min的速率測(cè)量各樣本的斷裂載荷(N)，并用下列公式計(jì)算各組樣本的斷裂強(qiáng)度和斷裂強(qiáng)度降低率。

斷裂強(qiáng)度=斷裂載荷(N)/橫截面積(mm2)

斷裂強(qiáng)度降低率(%)=(降解前斷裂強(qiáng)度－降解后斷裂強(qiáng)度)/降解前斷裂強(qiáng)度×100%

1.4.3 纖維膜降解前后形貌

在質(zhì)量測(cè)試后分別從降解0、2、4、6周各組中隨機(jī)抽取2個(gè)樣本，真空干燥后噴金，掃描電鏡(SEM)觀察各組降解前后PLGA·SEP和PLGA纖維膜的表面形貌。

1.4.4 降解前后DTA測(cè)試

取質(zhì)量測(cè)量后各組剩余的2個(gè)樣本，用DTA·TG熱重分析儀在掃描范圍10～500℃，升溫速度20℃/min的條件下，測(cè)量各樣本的熱分解溫度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PLGA·SEP和PLGA電紡纖維膜降解前后質(zhì)量變化(圖1)

兩種電紡纖維膜均隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，失重率逐漸增加;降解兩周時(shí)，失重最快，分別為13.84%和11.27%;而從2周到6周失重率增加的速度明顯減慢;僅增加了9.3%和10.2%左右。在降解6周時(shí)PLGA·SEP、PLGA纖維膜仍保持降解前質(zhì)量的 76.86%，78.46%。在降解 2、4、6 周各時(shí)間點(diǎn)，PLGA·SEP纖維膜的失重率均高于PLGA纖維膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 PLGA·SEP和PLGA電紡纖維膜降解前后斷裂強(qiáng)度變化(表2)

兩種纖維膜的斷裂強(qiáng)度均隨降解時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，降解兩周時(shí)，下降較快，PLGA－SEP和PLGA纖維膜的斷裂強(qiáng)度分別下降了38.79%和34.11%;兩周后下降速度減慢，到6周時(shí)，兩種纖維膜仍保持降解前斷裂強(qiáng)度的46.48%，48.33%，分別為 2.02 MPa，2.22 MPa。在降解 2、4、6 周時(shí)，PLGA－SEP纖維膜的斷裂強(qiáng)度下降率均高于PLGA纖維膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 兩種電紡纖維膜不同降解時(shí)間的斷裂強(qiáng)度(MPa，))

表2 兩種電紡纖維膜不同降解時(shí)間的斷裂強(qiáng)度(MPa，))

*與PLGA相比P＜0.05;不同字母為組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)相比P＜0.05

降解時(shí)間(周)SEP降解前 降解后 下降率(%)PLGA·PLGA降解前 降解后 下降率(%)24.35 ±1.12 2.61 ±0.13 38.79 ±2.93*A 4.32 ±1.02 3.03 ±0.14 34.11 ±2.94A 4.31 ±1.07 2.40 ±0.07 44.89 ±1.76*B 4.30 ±1.05 2.59 ±0.17 43.64 ±3.59B 64.33 ±1.10 2.02 ±0.05 53.52 ±1.20*C 4.29 ±1.10 2.22 ±0.08 51.67 ±1.794 C

2.3 PLGA·SEP和PLGA電紡纖維膜降解前后形貌變化(圖2)

掃描電鏡觀察可見:PLGA·SEP和PLGA兩種電紡纖維膜在降解前均呈相互交聯(lián)的多孔網(wǎng)狀無紡結(jié)構(gòu)，纖維交錯(cuò)相疊、光滑均一，沒有明顯的珠狀膨大結(jié)構(gòu)或纖維粘連現(xiàn)象;降解2周時(shí)，纖維吸水溶脹，纖維直徑變粗;降解6周時(shí)，纖維表面粗糙，纖維發(fā)生粘連，孔徑變小，但沒有出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。

圖2 PLGA·SEP和PLGA電紡纖維膜不同降解時(shí)期表面形貌(×5000)(A為PLGA·SEP纖維膜，B為PLGA纖維膜)

2.4 PLGA·SEP和PLGA電紡纖維膜降解前后DTA分析(圖3)

PLGA·SEP和PLGA纖維膜在降解前和降解不同時(shí)期都有一個(gè)吸熱峰，這是纖維膜的分解吸熱峰，并且隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，纖維膜的熱分解溫度逐漸降低。無論在降解前(0周)，還是降解2、4、6周，PLGA纖維膜的熱分解溫度均高于PLGA·SEP纖維膜，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

圖3 PLGA·SEP和PLGA電紡纖維膜不同降解時(shí)期的DTA曲線

3 討論

生物降解過程非常復(fù)雜，當(dāng)水分進(jìn)入聚合物本體后，可引起化學(xué)降解，產(chǎn)生齊聚物和小分子單體，同時(shí)聚合物本體形成孔洞，改變了聚合物的微觀結(jié)構(gòu)，最終由于齊聚物和單體的釋放而使聚合物質(zhì)量損失。另外，降解過程中還伴隨著一些物理、化學(xué)變化，如分子量減小、機(jī)械強(qiáng)度下降等。

本研究中將電紡的PLGA·SEP混合纖維膜和PLGA纖維膜(對(duì)照)浸泡于模擬體液(SBF)中，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，降解程度加深，部分降解產(chǎn)物溶于SBF中造成質(zhì)量損失。在降解前2周，纖維膜質(zhì)量損失最快，之后速度變慢。這是因?yàn)镻LGA為聚酯高聚物，體外降解主要是通過酯鍵的水解進(jìn)行的［7－8］，通過溶蝕作用，PLGA 由不溶于水變成溶于水，整體結(jié)構(gòu)逐漸被破壞，體積變小，最終降解生成二氧化碳和水。在降解過程中，分子鏈中酯鍵的水解、斷裂是無規(guī)則的，每個(gè)酯鍵都可能被水解，在降解初期多為一些分子量較小的分子降解，產(chǎn)物的分子量較小使其易游離出聚合物基體，造成質(zhì)量損失較快;隨著降解的進(jìn)行，分子量較大的分子緩慢降解，產(chǎn)物的分子量還未小到可以擴(kuò)散到纖維外部，使得降解后期的失重率增加緩慢。在降解2、4、6周各周期，PLGA·SEP纖維膜的失重率、斷裂強(qiáng)度降低率均高于PLGA纖維膜，說明纖維膜的降解速度與膜的親水性有關(guān)，因?yàn)镾EP為含有眾多親水基團(tuán)的親水性高分子，PLGA為不溶于水的高聚物，SEP的加入使得PLGA·EP纖維膜的親水性強(qiáng)于PLGA纖維膜，導(dǎo)致其降解速度快于PLGA纖維膜。PLGA·SEP和PLGA兩種電紡纖維膜的分解熱吸收峰值均呈降低趨勢(shì)，這是因?yàn)樵诮到膺^程中，PLGA、SEP大分子鏈?zhǔn)艿剿肿幼饔帽浑S機(jī)切斷，分子鏈排列變得更加無序，分子間作用力減小，使其分解吸熱溫度逐漸降低?？山到獠牧想S著降解時(shí)間的延長(zhǎng)其力學(xué)性能必然下降，通過測(cè)量斷裂強(qiáng)度可以掌握材料在一定時(shí)間內(nèi)所保持的力學(xué)性能，以滿足組織再生所需要的時(shí)間。在降解前2周，PLGA·SEP纖維膜和PLGA纖維膜斷裂強(qiáng)度均快速下降，這是因?yàn)樵诮到獬跗谒诌M(jìn)入纖維膜的孔隙使其吸水溶脹，破壞了纖維分子之間的作用力，導(dǎo)致斷裂強(qiáng)度下降較快，但6周時(shí)，PLGA·SEP纖維膜的斷裂強(qiáng)度仍保持了46.48%，與PLGA相近，且SEM觀察纖維膜結(jié)構(gòu)仍保持完整。研究表明，牙周膜細(xì)胞(PDLs)在術(shù)后1～2周再生能力最強(qiáng)，第3周后再生能力減弱，而上皮組織增生發(fā)生在術(shù)后前2周，因此GTR膜至少保持3～4周結(jié)構(gòu)完整性［9］。本研究制備的PLGA·SEP電紡納米纖維膜，在模擬體液中降解6周時(shí)仍保持結(jié)構(gòu)完整和一定的力學(xué)強(qiáng)度，符合GTR手術(shù)的要求，可作為一種可降解性GTR膜材料。

本研究只是從失重率、力學(xué)性能、纖維形貌變化及DTA測(cè)試觀察了PLGA·SEP纖維膜在體外降解過程中所發(fā)生的結(jié)構(gòu)、性能變化，還不能完全說明其在體內(nèi)的降解性以及對(duì)組織愈合的影響，因此，PLGA·SEP電紡纖維膜作為GTR膜臨床應(yīng)用，仍需進(jìn)一步研究。

［1］周藝群.可吸收性GTR膜材料的研究現(xiàn)狀與進(jìn)展［J］.中國(guó)口腔種植學(xué)雜志，2002，7(1):42－45.

［2］李雙燕.PLGA組織工程支架材料的研究與展望［J］.國(guó)外絲綢，2009，24(2):29－31.

［3］Yi F，Guo Z，Hu P，et al.Mimetics of eggshell membrane protein fibers by electrospinning［J］.Macromol Rapid Comm，2004，25(10):1038－1043.

［4］Lu J，Zhu Y，Guo Z，et al.Electrospinning of sodium alginate with poly(ethylene oxide)［J］.Polymer，2006，47(23):8026 －8031.

［5］Yi F，Guo ZX，Zhang LX，et al.Soluble eggshell membrane protein:preparation，characterization and biocompatibility［J］.Biomat，2004，25(19):4560 －4591.

［6］Christgau M，Schmalz G.Periodontal regeneration of intrabony defects with resorbable and non－resorbable membranes:30－month results.［J］.J Clin Periodontol，1997，24(1):17 － 27.

［7］Jong M，Kim K.Co－effect of aqueous solubility of drugs and glycolide monomer on in vitro release rates from poly(D，L－lactide－co－glycolide)discs and polymer degradationol［J］.Bomater sci Pdym Ed，2005，1(8):87－102.

［8］Duane T，Birnbaum L，Brannon P.Molecular weight distribution changes during degradation and release of PLGA nanoparticles containing epirubicin HCl.［J］.J Biomater Sci Pdym Ed，2003，14(1):87－102.

［9］Hosokawa R Kikuzaki K，Kimoto T.Controlled local application of fibroblast growth factor(FGF－2)accelerates the healing of GBR:an experimental study in beagle dogs.［J］.Clin Oral Implants Res，2000，4(11):345－353.