氫氧化鈣和洗必泰抑制糞腸球菌的抗菌性檢測(cè)

陳貴敏，潘 煒，葛蘭蘭

(南京軍區(qū)福州總醫(yī)院口腔科，福建 福州 350025)

根管內(nèi)細(xì)菌在根尖周炎的發(fā)生發(fā)展起著重要作用，牙髓治療的目的就是去除根管內(nèi)的微生物［1］。目前盡管機(jī)械清理和根管預(yù)備可以減少根管內(nèi)的微生物，但還不能完全清除側(cè)支根管、副根管和根尖分歧等部位的微生物［2］。因此，合理的根管用藥對(duì)于進(jìn)一步降低根管內(nèi)細(xì)菌是必需的。

氫氧化鈣是牙髓治療中一種常用的藥物，可通過(guò)增加環(huán)境中的pH值而發(fā)揮抗菌作用［3］。洗必泰因具有廣譜的抗菌性也被作為根管治療藥物用于臨床，而且當(dāng)洗必泰和陰離子結(jié)合后還可以逐步釋放，能保持長(zhǎng)久的抗菌性［4］。有研究報(bào)道氫氧化鈣與洗必泰聯(lián)合使用比單獨(dú)使用氫氧化鈣具有更好的抗菌性，同時(shí)也具有良好的生物相容性，因此不會(huì)對(duì)后續(xù)的根管充填產(chǎn)生影響［5］。

糞腸球菌是一種G+菌，是持續(xù)性感染根管中最常檢出的細(xì)菌，而且可以進(jìn)入到牙本質(zhì)小管深層，具有抵抗牙髓治療過(guò)程中殺菌劑的作用［6］。此外糞腸球菌還具有一定的耐饑餓能力，位于牙本質(zhì)小管中的糞腸球菌由于營(yíng)養(yǎng)不足，經(jīng)常處于一種饑餓狀態(tài)，饑餓態(tài)的糞腸球菌具有更強(qiáng)的抵抗抗菌劑的能力［7－8］。本研究旨在觀察比較洗必泰單獨(dú)或與氫氧化鈣聯(lián)合使用對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌的殺菌效果。

1 材料和方法

1.1 離體牙和菌株準(zhǔn)備

收集因正畸減數(shù)拔除的60個(gè)單根牙，PBS清洗表面，用Protaper根管銼預(yù)備至F3后，分別從釉牙本質(zhì)界下2 mm處和根尖上4 mm處截除牙冠和根尖，保留牙根中段約8 mm，貯存于生理鹽水中備用。?。?0℃凍存的糞腸球菌ATCC 29212(上海坤肯生物化工有限公司)，劃線接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基(Difco，美國(guó))，37℃厭氧環(huán)境下(800 mL/L N2，100 mL/L CO2，100 mL/L H2)培養(yǎng)24 h，挑單克隆菌落接種于5 mL的BHI培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)，調(diào)細(xì)菌密度為109cfu/mL，備用。

1.2 感染根管模型的構(gòu)建

所有牙根標(biāo)本經(jīng)120℃高溫高壓滅菌處理20 min后，隨機(jī)抽取1個(gè)根管標(biāo)本置BHI培養(yǎng)液中，分別置37℃厭氧條件和孵箱中各培養(yǎng)24 h，確定無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)后(以培養(yǎng)液未見(jiàn)混濁為滅菌成功)，把所有牙根標(biāo)本置24孔板中，每孔中一個(gè)牙根標(biāo)本，然后加入糞腸球菌菌懸液，并使之浸沒(méi)牙根，37℃厭氧條件下培養(yǎng)21 d，每3 d更換1次新鮮菌懸液，并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色和形態(tài)學(xué)鑒定。培養(yǎng)21 d后，取出所有標(biāo)本用無(wú)菌生理鹽水沖洗，吸潮紙尖干燥，并隨機(jī)抽取一個(gè)感染的根管模型進(jìn)行固定，梯度脫水，干燥，進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.3 根管封藥

將60個(gè)成功建立糞腸球菌感染的根管，隨機(jī)分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)空白對(duì)照組，每組15個(gè)牙根，分別用注射器將氫氧化鈣糊劑(Meta PEX，美國(guó))、20 g/L洗必泰凝膠、氫氧化鈣糊劑聯(lián)合20 g/L洗必泰凝膠、無(wú)菌生理鹽水(空白對(duì)照組)注滿(mǎn)相應(yīng)組的各樣本根管腔內(nèi)，直至溢出為止，所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。然后去除溢出的藥物，用丁香油水門(mén)汀封閉各樣本冠方和根方開(kāi)口，每一標(biāo)本均用無(wú)菌濕紗片覆蓋，培養(yǎng)皿中37℃置放14 d。

1.4 殺菌效果觀察

封藥14 d后，去除各樣本暫封材料，用5 mL無(wú)菌PBS沖洗根管兩次，再根據(jù)不同藥物分別使用相應(yīng)的中性液沖洗以中和根管內(nèi)的藥物(5 g/L檸檬酸中和氫氧化鈣，0.5%吐溫80和0.07%大豆卵磷脂中和20 g/L洗必泰凝膠)，再用無(wú)菌生理鹽水沖洗1次，紙尖干燥根管。每個(gè)標(biāo)本先用5號(hào)GG鉆鉆取根管內(nèi)壁深約 0～100μm，同時(shí)用10 mL無(wú)菌生理鹽水沖洗并收集洗出液，然后再用6號(hào)GG鉆鉆取根管內(nèi)壁深約100～200μm，同時(shí)用10 mL無(wú)菌生理鹽水沖洗，并收集洗出液，將兩次收集的含有牙本質(zhì)碎屑的洗出液分別置15 mL離心管中高速離心(10000 r/min，4℃，10 min)，棄上清，加入1 mL BHI培養(yǎng)液充分震蕩2 min，進(jìn)行10倍梯度稀釋后，取100 μL鋪于BHI瓊脂平板表面，37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算各組的活菌數(shù)，取對(duì)數(shù)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，兩兩比較采用 Tukey HSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌感染根管模型的確定

建模21 d后，掃描電鏡發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)小管內(nèi)有較多的糞腸球菌存在，并且小部分糞腸球菌已滲入到牙本質(zhì)小管的深層(圖1)。

圖1 糞腸球菌感染根管模型，牙本質(zhì)小管內(nèi)見(jiàn)有糞腸球菌(5000×)

2.2 各處理組不同深度牙本質(zhì)糞腸球菌計(jì)數(shù)

無(wú)論在根管壁深0～100μm處還是在100～200μm處，空白對(duì)照組均有大量的細(xì)菌生長(zhǎng)。而3個(gè)實(shí)驗(yàn)組根管內(nèi)糞腸球菌生長(zhǎng)則明顯減少，分別與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。各實(shí)驗(yàn)組之間相比，氫氧化鈣組活菌數(shù)最高，與其他兩組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其次為洗必泰組，洗必泰聯(lián)合氫氧化鈣組最低，但與單獨(dú)使用洗必泰組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(圖2)。

圖2 各處理組不同深度牙本質(zhì)樣本糞腸球菌計(jì)數(shù)比較(log，)

3 討論

牙髓治療的主要目的徹底去除根管內(nèi)的感染物質(zhì)和微生物，雖然生理性的機(jī)械預(yù)備可以去除根管內(nèi)大部分微生物，但由于根管系統(tǒng)的復(fù)雜性，合理的根管用藥是必不可少的。文獻(xiàn)報(bào)道根管中糞腸球菌具有高度抵抗抗菌劑的能力，主要因?yàn)楦苤械募S腸球菌可能處于一種饑餓狀態(tài)，而饑餓態(tài)糞腸球菌具有更強(qiáng)的抵抗抗菌劑的能力;此外，糞腸球菌還可以進(jìn)入牙本質(zhì)小管深層，躲避藥物的作用［7－9］。而且糞腸球菌具有極強(qiáng)的生命力和適應(yīng)能力，目前尚缺乏治療糞腸球菌感染的理想藥物。雖然氫氧化鈣可以有效去除很多微生物，但一些相關(guān)的研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌對(duì)氫氧化鈣具有一定的抵抗能力［10－12］，而對(duì)洗必泰可能更敏感［13］。

氫氧化鈣的抗菌特性主要?dú)w于其堿性和破壞細(xì)胞膜、致蛋白質(zhì)變性、破壞細(xì)菌DNA的能力［3］;洗必泰可穿透細(xì)菌而對(duì)細(xì)菌發(fā)揮毒性作用［14］。氫氧根離子和洗必泰均可通過(guò)分裂細(xì)胞膜而發(fā)揮殺菌作用。此外，洗必泰可以在堿性環(huán)境下誘導(dǎo)活性氧簇的產(chǎn)生，活性氧簇產(chǎn)物可通過(guò)氧化亞氮破壞細(xì)胞壁和質(zhì)膜，從而抑制糞腸球菌生長(zhǎng)［15］。但是也有研究報(bào)道，洗必泰和氫氧化鈣結(jié)合后，會(huì)降低洗必泰的抗菌活性［16］。本研究表明洗必泰單獨(dú)和聯(lián)合氫氧化鈣其抗菌性沒(méi)有明顯差異，并且洗必泰結(jié)合氫氧化鈣糊劑可以長(zhǎng)期保存于根管中，對(duì)根除持續(xù)性感染的致病菌起著比較重要作用。

本研究在建立糞腸球菌感染根管模型的基礎(chǔ)上，分別觀察了氫氧化鈣、洗必泰以及氫氧化鈣聯(lián)合洗必泰根管封藥對(duì)根管內(nèi)糞腸球菌抗菌性，結(jié)果顯示，各藥物處理組均對(duì)糞腸球菌有一定的抑制作用，其中以氫氧化鈣聯(lián)合洗必泰組最好，但洗必泰單獨(dú)或聯(lián)合氫氧化鈣時(shí)對(duì)糞腸球菌的抑制作用無(wú)明顯差異，與Zerella等研究相一致［13］。而氫氧化鈣的抗菌性最弱，提示洗必泰在牙髓治療中，特別針對(duì)糞腸球菌感染時(shí)可能更有效。

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