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      放線菌612243產(chǎn)除草活性代謝產(chǎn)物的研究

      2011-07-26 01:53:58宗志友徐文平陶黎明
      化學(xué)與生物工程 2011年7期
      關(guān)鍵詞:生物農(nóng)藥農(nóng)用靶標(biāo)

      宗志友,周 瑜,徐文平,陶黎明

      (1.上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,上海 200234;2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院,上海 200237)

      近年來(lái),生物農(nóng)藥因其具有能克服化學(xué)農(nóng)藥對(duì)生態(tài)環(huán)境的污染和減少在農(nóng)副產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留量等優(yōu)勢(shì),在病蟲(chóng)害綜合防治中的作用愈來(lái)愈重要,地位也愈來(lái)愈凸顯,其中微生物農(nóng)藥是生物農(nóng)藥最重要的組成部分。

      微生物農(nóng)藥主要包括活體微生物農(nóng)藥和農(nóng)用抗生素兩大部分[1]。農(nóng)用抗生素是在醫(yī)用抗生素的應(yīng)用基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,最早人們嘗試用醫(yī)用土霉素、鏈霉素防治某些果樹(shù)、蔬菜上的病害,收到意想不到的效果,由此引發(fā)了農(nóng)用抗生素的研究,距今不過(guò)幾十年的歷史。日本的農(nóng)用抗生素研究發(fā)展最快,居于世界領(lǐng)先地位,先后開(kāi)發(fā)出了春日霉素、滅瘟素、多氧霉素、有效霉素、滅孢素等[3]。世界上許多國(guó)家如美、日、意、俄、丹麥、印度等已將農(nóng)用抗生素的研究列入國(guó)家發(fā)展的重點(diǎn)規(guī)劃中。近年來(lái),我國(guó)也將生物農(nóng)藥列入國(guó)家重點(diǎn)發(fā)展規(guī)劃,取得了很大的成績(jī),生物農(nóng)藥的生產(chǎn)企業(yè)也達(dá)到一定的規(guī)模[4]。

      作者在農(nóng)用抗生素篩選的過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)一株放線菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有良好的除草活性,為此對(duì)這株微生物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了發(fā)酵和分離提取純化,獲得了一個(gè)除草活性化合物。在此報(bào)道了該化合物的結(jié)構(gòu)解析和生物活性研究。

      1 實(shí)驗(yàn)

      1.1 材料、培養(yǎng)基和儀器

      供試菌株612243,由上海南方農(nóng)藥研究中心分離純化自貴州高原地區(qū)的土樣;除草劑篩選靶標(biāo)均由上海南方農(nóng)藥研究中心提供。

      種子培養(yǎng)基(g·L-1):葡萄糖5,淀粉5,蛋白胨1,牛肉膏1,酵母膏1,瓊脂粉15,pH值自然。

      液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1):花生粉25,葡萄糖20,淀粉10,酵母膏4,氯化鈉1,牛肉膏1,磷酸氫二鉀0.005,pH值7.0~7.2。

      Agilent1200MS-LC型液質(zhì)聯(lián)機(jī)色譜儀;東芝UV-2501PC型紫外全光譜掃描儀;Bruker Avance 500 MHz型核磁共振儀;氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(英國(guó)質(zhì)譜公司Micromass GCTTM);液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(英國(guó)質(zhì)譜公司Micromass LCTTM)等。

      1.2 活性產(chǎn)物的分離純化

      將培養(yǎng)好的斜面種子接種于已消毒的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在28 ℃下振蕩培養(yǎng)96 h,得到發(fā)酵液30 L。將發(fā)酵液于5000 r·min-1離心20 min,將沉淀部分用10 L 80%丙酮浸泡過(guò)夜。冷凍離心去除沉淀,將上清液減壓旋轉(zhuǎn)濃縮去除丙酮,然后與發(fā)酵液合并。用2 BV的正丁醇萃取3次,合并正丁醇相濃縮得到油狀物,再用甲醇溶解,過(guò)濾去除甲醇不溶物,濃縮去除甲醇,得黃褐色油狀物25 g。經(jīng)硅膠柱層析分離(以二氯甲烷∶甲醇為40∶1至1∶5的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫),根據(jù)生物活性跟蹤結(jié)果,將活性部分濃縮,得淡黃色粉末狀固體1.1 g。用少量甲醇溶解,進(jìn)行TLC制備(以甲醇∶二氯甲烷=1∶40為展開(kāi)劑),將Rf值為0.35的具有除草活性的條帶刮下,用無(wú)水甲醇浸泡2 h,過(guò)濾,濾液減壓濃縮至10 mL左右,再用制備型HPLC進(jìn)一步分離純化(制備柱型號(hào):VP250/21 Nucleosil 100-7 C18,612243-B流動(dòng)相為甲醇∶水=75∶25,流速16 mL·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm)。收集活性單峰,濃縮,得白色粉末狀純品612243-B 25.8 mg,純度為96%,對(duì)純品進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。整個(gè)分離純化過(guò)程以除草活性為生物活性跟蹤。

      1.3 生物活性測(cè)定

      除草活性初篩采用黃瓜、莧菜、油菜、馬唐、小麥和稗草的種子萌發(fā)抑制實(shí)驗(yàn)。復(fù)篩采用鯉腸、莧菜、小藜、馬唐、狗尾和稗草的盆栽測(cè)定。

      1.4 結(jié)構(gòu)鑒定

      將HPLC制備的活性組分612243-B溶解于0.5 mL CDCl3中,分別進(jìn)行核磁共振掃描。記錄1HNMR、13CNMR、DEPT90、DEPT135、COSY、NOESY、HMQC和HMBC等譜圖信息。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 化合物612243-B結(jié)構(gòu)的確定

      根據(jù)612243-B電噴霧質(zhì)譜圖(ESI),可知612243-B[M+K+]=616、[M+Na+]=600、[M+H+]=578,計(jì)算出該物質(zhì)的分子量M=577。根據(jù)氮元素規(guī)則,分子中應(yīng)該含有奇數(shù)個(gè)氮原子。該化合物的相關(guān)核磁數(shù)據(jù)見(jiàn)表1和表2。

      表1 化合物612243-B的δC及其HMQC相關(guān)的δH

      表2 化合物612243-B的1H-1H COSY和13C-1H HMBC信息/ppm

      由表1、表2的數(shù)據(jù)可以確定化合物612243-B具有1個(gè)含4個(gè)雙鍵的17個(gè)C的長(zhǎng)鏈,1位C上有1個(gè)多位取代的吡啶基團(tuán),10位C上有1個(gè)葡萄糖基團(tuán),具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

      圖1 化合物612243-B的結(jié)構(gòu)式

      查閱文獻(xiàn)[4,5],確認(rèn)化合物612243-B為葡糖基殺粉蝶菌素(Glucopiericidin A),分子式為C31H47NO9。

      2.2 化合物612243-B生物活性分析

      由于葡糖基殺粉蝶菌素是已知的殺蟲(chóng)活性物質(zhì),未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其除草活性,為此進(jìn)行了化合物612243-B的除草活性研究。離體除草活性生測(cè)采用杯碟法。具體生物活性見(jiàn)表3~表5。

      表3 化合物612243-B的除草活性

      表4 化合物612243-B莖葉處理鮮重防效結(jié)果

      表5 化合物612243-B土壤處理結(jié)果

      2.3 討論

      經(jīng)文獻(xiàn)查閱,未發(fā)現(xiàn)Glucopiericidin A具有除草活性的報(bào)道。用化合物Glucopiericidin A對(duì)不同植物進(jìn)行莖葉處理時(shí),該藥劑最佳起效時(shí)間為3 d左右,以后藥物可能被分解,植株主要表現(xiàn)為發(fā)黃、矮化、生長(zhǎng)較弱,且受濃度影響?;衔?12243-B施藥20 d后,未死植株長(zhǎng)勢(shì)慢慢恢復(fù),比CK小,說(shuō)明施藥后抑制其生長(zhǎng)速度,會(huì)使雜草在與正常非靶標(biāo)植物競(jìng)爭(zhēng)中失去優(yōu)勢(shì),營(yíng)養(yǎng)被作物奪取,達(dá)到施藥目的。施藥20 d的鮮重結(jié)果發(fā)現(xiàn),612243-B土壤處理靶標(biāo)均無(wú)效果,而觀察莖葉處理后的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn),612243-B對(duì)雙子葉靶標(biāo)的藥效要優(yōu)于禾本科靶標(biāo)。可以得出土壤處理的防效遠(yuǎn)低于莖葉處理的防效。這一結(jié)果可能與土壤吸附性或藥劑傳導(dǎo)性有關(guān)。

      3 結(jié)論

      在微生物農(nóng)藥的篩選過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)編號(hào)為612243的放線菌株可產(chǎn)生除草活性物質(zhì)。根據(jù)除草活性跟蹤的結(jié)果,將其發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行溶劑萃取、層析及高效液相色譜制備等一系列的分離純化處理,獲得一個(gè)活性化合物612243-B。質(zhì)譜分析表明,該化合物分子量為577、分子式為C31H47NO9;經(jīng)其它光譜分析并對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù),確定該化合物與已知的葡糖基殺粉蝶菌素(Glucopiericidin A)相同,但未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其除草活性的研究。

      [1] 陳軼林,張承來(lái).微生物源活性物質(zhì)的開(kāi)發(fā)與化學(xué)新農(nóng)藥的創(chuàng)制[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,(3):102-104.

      [2] 李勇,楊慧敏.微生物農(nóng)藥的研究和應(yīng)用進(jìn)展[J].貴州農(nóng)藥科學(xué),2003,31(2):62-63.

      [3] 朱昌雄,宋淵.我國(guó)農(nóng)用抗生素的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)探討[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào),2006,8(6):17-19.

      [4] Matsumoto M,Mogi Kin-ichi,Nagaoka Katsuhiko,et al. New piericidin glucosides,glucopiericidins A and B[J].The Journal of Antibiotics,1987,40(2):149-156.

      [5] Funayama Shinji, Ishibashi Masami, Anraku Yumi, et al.Novel cytocidal antibiotics,glucopiericidins A1 and A2. Taxonomy,fermentation,isolation,structure elucidation and biological characteristics[J].The Journal of Antibiotics,1989,42(12):1734-1740.

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