辣根過(guò)氧化物酶催化合成水溶性導(dǎo)電聚苯胺的研究

白利杰，陳建波

(上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

自1977年首次發(fā)現(xiàn)摻雜碘的聚乙炔具有金屬特性以來(lái)，導(dǎo)電聚合物受到了廣泛關(guān)注。其中聚苯胺(PANI)由于結(jié)構(gòu)多樣、摻雜機(jī)制獨(dú)特、穩(wěn)定性高、應(yīng)用前景廣闊更是備受矚目[1]。傳統(tǒng)的聚苯胺合成方法有化學(xué)合成法和電化學(xué)合成法，但均存在因過(guò)氧化導(dǎo)致副產(chǎn)物較多的缺點(diǎn)。此外，聚苯胺在普通的有機(jī)溶劑和溶液中的溶解性很低，也限制了它在工業(yè)中的應(yīng)用，因此人們致力于尋求更好的催化方式[1，2]。酶因?yàn)榫哂休^高的催化效率及對(duì)底物高度的專一性，且其催化的聚合過(guò)程溫和、環(huán)保，產(chǎn)物容易分離，副產(chǎn)物很少，因而酶催化在高聚物合成領(lǐng)域越來(lái)越受到人們的關(guān)注。目前已經(jīng)應(yīng)用于導(dǎo)電聚苯胺合成研究的生物酶包括辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、漆酶、棕櫚樹(shù)過(guò)氧化物酶等[3～5]。

辣根過(guò)氧化物酶(HRP)是一種以鐵卟啉為輔基的血紅素蛋白，在H2O2存在時(shí)能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合，由于穩(wěn)定性較好、價(jià)廉，已被廣泛應(yīng)用于聚合物的合成。但是在一般條件下HRP酶催化苯胺聚合過(guò)程中會(huì)得到低分子量的寡聚體，這些由于快速聚合形成的非導(dǎo)電性的寡聚體因不溶于水而很快沉淀出來(lái)。這一問(wèn)題可以通過(guò)引入聚陰離子模板來(lái)解決。聚陰離子模板能夠促進(jìn)苯胺單體的頭尾連接，從而使高分子量的苯胺聚合物能夠在水溶液中存在。文獻(xiàn)報(bào)道可作為酶催化苯胺聚合模板的有聚苯乙烯磺酸鈉(SPS)、聚乙烯磷酸鹽(PVP)、磺化木質(zhì)素(LGS)及 DNA(RNA)等[3，6～8]。

在酶催化制備導(dǎo)電聚苯胺過(guò)程中，酶不可避免地會(huì)受到體系中各種條件的影響，酶催化活性的變化最終影響導(dǎo)電聚苯胺的合成。目前，文獻(xiàn)報(bào)道多側(cè)重導(dǎo)電聚苯胺的合成，而對(duì)生物酶的變化研究較少，因此，對(duì)生物酶在催化導(dǎo)電聚苯胺合成過(guò)程中性質(zhì)的變化并不十分清楚。為拓展酶催化導(dǎo)電聚苯胺的研究，作者以十二烷基硫酸鈉(SDS)為模板，研究了在SDS膠束溶液中HRP催化聚合導(dǎo)電聚苯胺的影響因素，并對(duì)合成過(guò)程中HRP性質(zhì)的變化進(jìn)行了探索。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑

辣根過(guò)氧化物酶，上海Kayon生物試劑公司；苯胺，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉，純度≥99%，Sigma；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 聚合反應(yīng)

用pH值為1.0～4.0的緩沖溶液配制一定濃度的SDS溶液，加入10 mmol·L-1的苯胺單體和0.1 mL 10 mg·mL-1HRP溶液，將稀釋的H2O2溶液逐滴加入(控制滴加時(shí)間為1 h)到反應(yīng)體系中。滴加完畢，再繼續(xù)反應(yīng)16 h。用50%的丙酮-水溶液破乳，沉淀濾除后再用水洗，放入真空干燥箱，50℃干燥48 h得聚苯胺粉末。

1.3 HRP活性測(cè)定

反應(yīng)在含有(或不含)10 mmol·L-1SDS的不同pH值的0.2 mmol·L-1Na2HPO4-檸檬酸緩沖溶液中進(jìn)行，以10 mmol·L-1鄰甲氧基苯酚為底物、HRP為催化劑，用H2O2引發(fā)反應(yīng)后立即放置分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)470 nm處吸光度的變化。

以每分鐘OD470變化0.01為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.4 產(chǎn)物表征

用UV-雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)測(cè)聚合物的紫外可見(jiàn)光譜；用Nicolet 170SX型FTIR光譜儀(美國(guó)Nicolet)測(cè)聚合物的紅外光譜，KBr壓片法制樣；用HMS-775型電導(dǎo)率儀(Lakeshore公司)測(cè)聚合物的電導(dǎo)率；用DTG-60H型熱解重量分析儀(日本島津公司)測(cè)聚合物的熱穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH值對(duì)聚合反應(yīng)的影響

pH值是合成導(dǎo)電聚苯胺過(guò)程中最重要的影響因素之一，苯胺只有在pH值低于4.6的條件下才能形成導(dǎo)電聚合物(苯胺的pKa為4.6)[9]。但酶活性在較低的pH值條件下會(huì)受到較大影響。研究了pH值在1.0～4.0范圍內(nèi)HRP催化苯胺聚合的反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmmol·L-1；[H2O2]=20 mmmol·L-1

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將H2O2滴加到反應(yīng)體系中后，pH值為1.0～3.0的反應(yīng)體系均為翠綠色透明溶液，而pH值為4.0的反應(yīng)體系則立即出現(xiàn)黑色沉淀。由圖1可知，pH值為4.0的反應(yīng)體系在700～900 nm范圍內(nèi)無(wú)吸收峰出現(xiàn)，而其在570 nm出現(xiàn)的吸收峰說(shuō)明有非導(dǎo)電性的支鏈聚合物產(chǎn)生；當(dāng)pH值降至3.0時(shí)，在700～900 nm范圍內(nèi)基本無(wú)吸收峰出現(xiàn)；當(dāng)pH值為2.0時(shí)，在750 nm有很強(qiáng)的吸收峰，說(shuō)明產(chǎn)生了導(dǎo)電聚苯胺；當(dāng)pH值進(jìn)一步降至1.0時(shí)，吸收峰減小且吸收峰的位置紅移至715 nm左右[9，10]。

對(duì)聚合產(chǎn)物干燥處理后所得粉末進(jìn)行電導(dǎo)率檢測(cè)，結(jié)果表明pH值為1.0～2.0的反應(yīng)體系得到了具有較高導(dǎo)電性的聚苯胺(表1)，且pH值為2.0的體系得到的聚合物電導(dǎo)率最高。表明HRP催化導(dǎo)電聚合物的最適pH值為2.0，因此后續(xù)反應(yīng)中選擇體系的pH值為2.0。

表1 不同pH值條件下得到的PANI的電導(dǎo)率

2.2 HRP催化苯胺聚合作用的探討

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，HRP在pH值低于4.3時(shí)會(huì)很快失去活力[11]，而SDS是一種陰離子表面活性劑，常作為蛋白變性劑應(yīng)用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，因此SDS的存在將降低酶的活性。測(cè)定含有SDS或不含SDS的體系中HRP的活力，結(jié)果見(jiàn)圖2。

注：[HRP]=2.75×10-3 mmol·L-1；[Guaiacol]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmol·L-1；[H2O2]=100 mmol·L-1

由圖2可知，含有SDS的體系在pH值1.6～3.0范圍內(nèi)幾乎不表現(xiàn)HRP活力；在不含SDS的體系中，pH值低于2.0時(shí)也幾乎沒(méi)有HRP活力；而pH值大于2.0時(shí)，HRP的活力隨著pH值的增大顯著增強(qiáng)。這說(shuō)明低pH值和SDS的存在都是造成HRP失活的原因。

為進(jìn)一步探討HRP在導(dǎo)電聚苯胺聚合反應(yīng)(以苯胺聚合體系在750 nm的吸光度表示，下同)中的作用，將HRP預(yù)先在沸水中處理15～30 min，使HRP在加入到聚合反應(yīng)體系之前就已經(jīng)失活，然后與未失活的HRP用于苯胺聚合反應(yīng)進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖3。

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmol·L-1；[H2O2]=20 mmol·L-1

由圖3可知，至少在8 h內(nèi)，不論是否經(jīng)過(guò)失活處理，HRP均能催化導(dǎo)電聚苯胺的合成。Nabid等曾運(yùn)用鐵卟啉和水溶性四磺酸化酞菁金屬為催化劑催化苯胺聚合，得到了導(dǎo)電聚苯胺[12，13]。因此，推測(cè)雖然HRP分子中的蛋白部分因嚴(yán)苛的反應(yīng)條件(低pH值和變性劑SDS的存在)而變性失活，但其活性中心的鐵卟啉仍然能夠不受環(huán)境條件的影響而發(fā)揮其催化苯胺聚合的作用。

2.3 H2O2濃度對(duì)聚合反應(yīng)的影響

選擇pH值為2.0的條件下考察H2O2濃度對(duì)苯胺聚合反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmol·L-1

由圖4可知，隨著H2O2濃度的增大，導(dǎo)電聚苯胺的吸收峰值也逐漸增強(qiáng)；當(dāng)H2O2濃度達(dá)到60 mmol·L-1時(shí)，產(chǎn)物的吸收峰趨于平穩(wěn)。但實(shí)驗(yàn)中觀察到，H2O2濃度過(guò)高時(shí)(>20 mmol·L-1)會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)副產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時(shí)考慮到較高濃度的H2O2會(huì)抑制HRP的活性，因此，選擇H2O2濃度保持在20 mmol·L-1左右為宜。

2.4 SDS濃度對(duì)聚合反應(yīng)的影響(圖5)

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[H2O2]=20 mmol·L-1

由圖5可知，SDS濃度為20 mmol·L-1時(shí)產(chǎn)物吸收峰很強(qiáng)，SDS濃度為40 mmol·L-1或小于10 mmol·L-1都會(huì)影響導(dǎo)電聚苯胺的生成。這是因?yàn)椋琒DS在水中可以形成膠束，這種膠束能夠?yàn)楸桨穯误w的聚合提供適合的環(huán)境，在pH值為2.0的條件下，SDS帶負(fù)電荷、苯胺單體帶正電荷，因而SDS自組裝形成的膠束將吸引苯胺單體在其周圍聚集，進(jìn)而促進(jìn)水溶性導(dǎo)電聚合物的產(chǎn)生。SDS的濃度過(guò)低(<8.6 mmol·L-1)時(shí)在水溶液中就無(wú)法形成膠束，從而失去模板導(dǎo)向作用，使得聚合反應(yīng)變慢，相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)導(dǎo)電聚合物的生成量較少。而SDS濃度太高又會(huì)顯著降低HRP的活性，也不利于導(dǎo)電聚合物的生成。因此，選擇SDS濃度在20 mmol·L-1為宜。

2.5 聚苯胺復(fù)合物的表征

2.5.1 FTIR(圖6)

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmol·L-1；[H2O2]=20 mmol·L-1

2.5.2 TGA(圖7)

注：[HRP]=0.1 mg·mL-1；[Aniline]=10 mmol·L-1；[SDS]=10 mmol·L-1；[H2O2]=20 mmol·L-1

由圖7可知，3種不同pH值下得到的PANI/SDS復(fù)合物在150℃以下都出現(xiàn)失重，在此溫度范圍內(nèi)失重的應(yīng)是水分。主要的失重出現(xiàn)在300℃以上，當(dāng)溫度升高到600℃時(shí)，3種PANI/SDS復(fù)合物保留率約30%，表明復(fù)合物具有較好的熱穩(wěn)定性。當(dāng)溫度升高到800℃時(shí)，pH值為3.0的條件下得到的PANI/SDS復(fù)合物保留率較其余兩種稍高，因此其熱穩(wěn)定性相對(duì)較好。

3 結(jié)論

以HRP為催化劑，在SDS膠束水溶液中進(jìn)行了水溶性導(dǎo)電聚苯胺的合成，對(duì)HRP在pH值1.0～4.0反應(yīng)體系中催化導(dǎo)電聚苯胺合成的反應(yīng)進(jìn)行了研究。紫外可見(jiàn)掃描光譜分析和電導(dǎo)率測(cè)定的結(jié)果表明，在以SDS為模板的條件下，HRP催化水溶性導(dǎo)電聚苯胺合成的最適pH值為2.0、最適的SDS和H2O2濃度都在20 mmol·L-1左右。進(jìn)一步測(cè)定HRP的活性發(fā)現(xiàn)，HRP pH值低于2.0時(shí)蛋白部分變性失活，但仍可催化導(dǎo)電聚苯胺的合成，推測(cè)HRP在催化導(dǎo)電聚苯胺的合成過(guò)程中主要依靠其活性中心的鐵卟啉發(fā)揮其催化作用。運(yùn)用FTIR和TGA等方法對(duì)合成的PANI/SDS復(fù)合物進(jìn)行了表征，該復(fù)合物具有典型的導(dǎo)電聚苯胺復(fù)合物特征以及較好的熱穩(wěn)定性。

[1] Bhadra S，Khastgira D，Singha N K.Progress in preparation，processing and applications of polyaniline[J].Progress in Polymer Science，2009，34(8)：783-810.

[2] Liu W，Kumar J，Tripat hy S，et al.Enzymatically synthesized conducting polyaniline[J].J Am Chem Soc，1999，121(1)：71-78.

[3] Samuelson L A，Anagnostopoulos A，Shridahra Alva，et al.Biologically derived conducting and water soluble polyaniline[J].Macromolecules，1998，31(13)：4376-4378.

[4] Karamyshev A V，Shleev S V，Koroleva O V，et al.Laccase-catalyzed synthesis of conducting polyaniline[J].Enzyme and Microbial Technology，2003，33(5)：556-564.

[5] Sakharov I Y，Vorobiev A C，Castillo J J.Synthesis of polyelectrolyte complexes of polyaniline and sulfonated polystyrene by palm tree peroxidase[J].Enzyme and Microbial Technology，2003，33(1)：661-667.

[6] Sangrama K S，Ramaswamy N，Sucharita R，et al.An enzymatically synthesized polyaniline：A solid state NMR study[J].Macromolecules，2004，37(11)：4130-4138.

[7] Nagarajan R，Trypathy S K，Kumar J，et al.An enzymatically synthesized conducting molecular complex of polyaniline and poly(vinylphosphonic acid)[J].Macromolecules，2000，33(26)：9542-9547.

[8] Nagarajan R，Liu W，Kumar J，et al.Manipulating DNA conformation using intertwined conducting polymer chains[J].Macromolecules，2001，34(1)：3921-3927.

[9] Hu X，Zhang Y Y，Tang K，et al.Hemoglobin-biocatalysts synthesis of a conducting molecular complex of polyaniline and sulfonated polystyrene[J].Synthetic Metals，2005，150(1)：1-7.

[10] Rodolfo C S，Jorge R G，Jose L A，et al.Template-free enzymatic synthesis of electrically conducting polyaniline using soybean peroxidase[J].European Polymer Journal，2005，41(5)：1129-1135.

[11] Chattopadhyay K，Mazumdar S.Structural and conformational stability of horseradish peroxidase：Effect of temperature and pH[J].Biochemstry，2000，39(11)：263-270.

[12] Nabid M R，Sedghi R，Jammat P R，et al.Synthesis of conducting water-soluble polyaniline with iron (Ⅲ) porphyrin[J].Applied Polymer Science，2006，102(3)：2929-2934.

[13] Nabid M R，Sedghi R，Jammat P R，et al.Catalytic oxidative polymerization of aniline by using transition-metal tetrasulfonated phthalocyanine[J].Applied Catalysis A：Genaral，2007，328(1)：52-57.

[14] Gu Y S，Chen C C，Ruan Z W.Enzymatic synthesis of conductive polyaniline using linear BSA as the template in the presence of sodium dodecyl sulfate[J].Synthetic Metals，2009，159(19-20)：2091-2096.