巨大芽孢桿菌Bacillus megaterium NCIB 8508蔗糖磷酸化酶生物催化合成α-熊果苷的研究

李群良，張欣英，楊克迪，姚評佳，魏遠安

(1.廣西大學化學化工學院，廣西 南寧530004； 2.廣西大學廣西亞熱帶生物資源保護利用重點實驗室，廣西 南寧530004)

熊果苷(Arbutin)，又名熊果甙、熊果素、熊果葉甙、熊果酚甙或楊梅甙，是一種源于杜鵑花科熊果屬的多年生常綠小灌木植物熊果葉子細胞里的成分，具有良好的皮膚美白效果，廣泛應用于化妝品行業(yè)[1]。

熊果苷的制備方法有天然產(chǎn)物提取法、植物組織培養(yǎng)法、化學合成法以及酶轉(zhuǎn)化法[2]。生物酶法主要以糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶作為催化劑，通過催化糖基轉(zhuǎn)移或逆水解反應合成熊果苷，其中轉(zhuǎn)糖基反應中酶底物為雙糖或多糖。糖基轉(zhuǎn)移酶能特異地催化糖基從糖基供體如UDPG衍生物轉(zhuǎn)移到目標產(chǎn)物，催化效率較高[3]。迄今為止已發(fā)現(xiàn)Leuconostocmesenteroides、Bacillussubtilis、Bacillusmacerans、Saccharomycescerevisiae、Rhizopussp.以及Xanthomonascampestris等微生物細胞能轉(zhuǎn)化合成熊果苷[4]。Wu等[5]研究了高密度細胞培養(yǎng)大腸桿菌表面錨定轉(zhuǎn)糖基酶作為全細胞生物催化劑合成α-熊果苷。Kitao等[6]首次報道了用Leuconostocmesenteroides蔗糖磷酸化酶轉(zhuǎn)化合成α-熊果苷。通過蔗糖磷酸化酶催化合成的熊果苷只有α-熊果苷，相比β-熊果苷，其美白效果高10倍以上，且不抑制人體細胞[7]。利用蔗糖磷酸化酶催化合成α-熊果苷具有專一性強、產(chǎn)品純度高及生產(chǎn)條件溫和等優(yōu)點，因此意義重大。

在前期研究中，作者首次驗證并鑒定了巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508中存在蔗糖磷酸化酶[8]，在此對該蔗糖磷酸化酶催化蔗糖與對苯二酚合成α-熊果苷進行了初步研究，其反應式如下：

1 實驗

1.1 菌株、試劑與培養(yǎng)基

巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIM 2087(即巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508)購于印度浦那國家化學實驗室(National Chemical Laboratory，Pune 411008，India)。

α-熊果苷標準品購自Sigma 公司，其它試劑為生化試劑。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，蛋白胨1.5 g，NaCl 0.5 g，牛肉膏0.05 g，蒸餾水100 mL，pH值7.0。

1.2 蔗糖磷酸化酶粗酶液的制備

無菌操作下，取一環(huán)菌株于種子培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)8 h，吸取發(fā)酵液分裝到新種子培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，8000 r·min-1冷凍離心20 min后收集菌體，用緩沖溶液洗滌菌體2次，超聲破碎細胞，離心，取上清液即為胞內(nèi)粗酶液。

1.3 α-熊果苷的生物合成

取上述胞內(nèi)粗酶液5 mL(其中濕菌體濃度為50 mg·mL-1)，加入反應物蔗糖和對苯二酚，30℃、180 r·min-1搖床反應24 h。取1 mL反應液，離心取上清液進行高效液相色譜檢測。對苯二酚的轉(zhuǎn)化率(x1)和選擇性(x2)依下式計算：

式中：M1為加入到反應液中的對苯二酚摩爾量；M2為反應消耗掉的對苯二酚摩爾量；M3為對應生成α-熊果苷的對苯二酚摩爾量。

1.4 高效液相色譜檢測條件

色譜條件：色譜柱為DiamonsilTMC18柱，5 μm，250 mm×4.6 mm； 柱溫25℃； 流動相為H2O ∶CH3OH = 95∶5；流速1 mL·min-1；檢測器為紫外檢測器；檢測波長280 nm；進樣量10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 緩沖溶液pH值對反應的影響

在反應底物對苯二酚濃度為5 mmol·L-1、對苯二酚與蔗糖摩爾比為1∶4的條件下，考察緩沖溶液pH值對反應的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 緩沖溶液pH值對反應的影響

從圖1可知，當緩沖溶液pH值為6.5時，α-熊果苷含量最大，對苯二酚的選擇性達到最高、轉(zhuǎn)化率也較高，這說明在pH值為6.5的緩沖溶液反應體系中，轉(zhuǎn)糖基作用最佳，且殘余對苯二酚量最少。這與Nomura等[9]報道的一致，當蔗糖磷酸化酶催化反應中受體為氫醌一族時，轉(zhuǎn)糖基作用的最適pH值偏中性。

2.2 緩沖溶液濃度對反應的影響

考察磷酸鹽緩沖溶液(pH值為6.5)濃度對反應的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 緩沖溶液濃度對反應的影響

從圖2可知，緩沖溶液濃度對α-熊果苷含量影響不是很明顯，緩沖溶液濃度達到30 mmol·L-1時，α-熊果苷含量最大，此時對苯二酚的選擇性也達到最高，但其轉(zhuǎn)化率相對最低。

2.3 對苯二酚濃度對反應的影響

50 mg·mL-1濕菌體所含蔗糖磷酸化酶量為定值，底物的起始濃度較低時，蔗糖磷酸化酶催化反應速度與對苯二酚濃度成正比，即生成的α-熊果苷量隨對苯二酚濃度的增加而增大；但當對苯二酚濃度超過一定值時，催化反應生成的α-熊果苷量不再隨著對苯二酚濃度的增加而增大?？疾鞂Ρ蕉訚舛葘Ψ磻挠绊?，結(jié)果見圖3。

圖3 對苯二酚濃度對反應的影響

從圖3可知，對苯二酚的選擇性和轉(zhuǎn)化率均隨著其濃度的增加先升高后降低，當對苯二酚濃度為5 mmol·L-1時，α-熊果苷含量最大，對苯二酚的選擇性與轉(zhuǎn)化率也達到最高。

2.4 反應物摩爾比對反應的影響

本實驗通過增加蔗糖的量來提高對苯二酚的轉(zhuǎn)化率，從而提高α-熊果苷的產(chǎn)量?？疾旆磻锬柋?對苯二酚與蔗糖摩爾比，下同)對反應的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 反應物摩爾比對反應的影響

從圖4可知，對苯二酚與蔗糖的摩爾比為1∶5時，α-熊果苷含量最大，對苯二酚的選擇性與轉(zhuǎn)化率也達到最高；繼續(xù)增加蔗糖的量，對苯二酚的選擇性與轉(zhuǎn)化率反而有所下降。

2.5 反應時間對反應的影響

考察反應時間對反應的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 反應時間對反應的影響

從圖5可知，反應時間為24 h時，對苯二酚的選擇性及α-熊果苷含量達到最高；繼續(xù)延長反應時間，對苯二酚的選擇性及α-熊果苷含量逐漸下降，而對苯二酚轉(zhuǎn)化率則逐漸上升，這可能與粗酶液中含有其它催化酶有關(guān)。

3 結(jié)論

采用巨大芽孢桿菌BacillusmegateriumNCIB 8508蔗糖磷酸化酶催化合成α-熊果苷，確定最佳反應條件如下：濕菌體50 mg·mL-1破碎細胞粗酶液催化合成α-熊果苷，pH值為6.5的磷酸鹽緩沖溶液濃度為30 mmol·L-1，反應溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，對苯二酚濃度為5 mmol·L-1，對苯二酚與蔗糖摩爾比為1∶5，反應時間為24 h。在此條件下，α-熊果苷含量達0.35 mg·mL-1，對苯二酚選擇性為4.0%，對苯二酚轉(zhuǎn)化率為74%。

由于實驗用酶為蔗糖磷酸化酶粗酶液，酶含量少，其催化合成α-熊果苷相對有限，致使反應物選擇性較低。為了進一步提高α-熊果苷產(chǎn)量，今后研究中可利用分子生物學方法構(gòu)建高表達蔗糖磷酸化酶基因的工程菌，以獲得酶活力高、穩(wěn)定性好的蔗糖磷酸化酶用于α-熊果苷的生產(chǎn)。

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