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    正交試驗比較金銀花藥材中綠原酸與木犀草苷的乙醇提取工藝

    2011-07-25 10:27:28閔春艷游本剛許瓊明李笑然唐麗華楊世林
    中成藥 2011年10期
    關鍵詞:草苷木犀轉(zhuǎn)移率

    閔春艷, 游本剛, 許瓊明, 李笑然, 唐麗華, 楊世林

    (1.蘇州藥品檢驗所,江蘇蘇州215002;2.蘇州大學醫(yī)學部藥學院,江蘇 蘇州215213)

    金銀花系忍冬科植物忍冬Lonicerae japonicae Thunb的干燥花蕾或帶初開的花,具有清熱解毒、涼風散熱之功效[1]。主要成分為有機酸類、黃酮類、揮發(fā)油類和皂苷類等[2-3],其中,木犀草苷是金銀花用以區(qū)別山銀花的特征性成分,也是其主要藥效成分之一。因此,在原有綠原酸質(zhì)量控制標準的基礎上,新增了木犀草苷作為2005年版、2010年版《中國藥典》金銀花質(zhì)量控制指標[4-5]。多年以來,在金銀花藥材的提取工藝及提取物質(zhì)量標準研究中,均是以綠原酸為質(zhì)控指標,而木犀草苷卻未引起足夠的重視[6-7]。本研究建立了HPLC法同時測定金銀花提取物中綠原酸與木犀草苷的方法,同時以兩種成分為指標,通過正交試驗設計優(yōu)化并比較了金銀花藥材的乙醇提取工藝。

    1 儀器與試劑

    高效液相色譜儀(配備SPD-M20A型二極管陣列檢測器,LC-20AT型泵,CTO-10ASVP型溫控柱溫箱,LC solution型色譜工作站,日本島津儀器公司);AS20500AT超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);電子分析天平(賽多利斯)。

    綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110753-200413);木犀草苷對照品(中國藥品生物制品檢定所,111720-200501);金銀花藥材(蘇州市天靈中藥飲片有限公司,批號071211-1);乙腈(色譜純,TEDIA公司);四氫呋喃(色譜純,國藥集團化學試劑有限公司);其余試劑均為分析純。

    2 實驗方法與結(jié)果

    2.1 綠原酸和木犀草苷的測定

    2.1.1 對照品溶液的制備

    精密稱取綠原酸對照品10.18 mg,置50 mL量瓶中,用50%甲醇溶解并定容至刻度,制得質(zhì)量濃度為203.6 μg/mL的綠原酸貯備液。

    精密稱取木犀草苷對照品10.06 mg,置50 mL量瓶中,用50%甲醇溶解并定容至刻度,制得質(zhì)量濃度為201.2 μg/mL的木犀草苷貯備液。

    2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取金銀花提取物樣品約20 mg,置10 mL量瓶內(nèi),加入50%甲醇溶解、定容至刻度,搖勻,濾過,即得。

    2.1.3 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm,5 μm);以乙腈-四氫呋喃(95 ∶5)為流動相 A,0.4% 磷酸為流動相B,采用梯度洗脫:0~8 min,88%B;8~10 min,80%B;10~25 min,80%B~75%B;綠原酸和木犀草苷的檢測波長分別為327 nm和350 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫 35 ℃;進樣量20 μL。

    分別取混合對照品溶液及供試品溶液,適當稀釋后采用上述色譜條件進樣,記錄色譜圖,結(jié)果見圖1。

    圖1 金銀花供試液在350 nm(A)和327 nm(B)的液相色譜圖及對照品溶液在350 nm(C)和327 nm(D)的液相色譜圖

    2.1.4 線性關系 精密量取上述兩種貯備液適量,用50%甲醇稀釋,分別得質(zhì)量濃度為 10.18、20.36、40.72、81.44、122.16、162.88 μg/mL 的綠原酸系列對照品溶液和質(zhì)量濃度為 2.012、4.024、8.048、12.072、16.096、20.12 μg/mL 的木犀草苷系列對照品溶液,按2.1.3項下色譜條件進樣,以對照品質(zhì)量濃度C對峰面積A進行線性回歸,得綠原酸的標準曲線方程為 A=58026C-120395(r=0.9999),線性范圍為10.18 ~162.88 μg/mL;木犀草苷的標準曲線方程為A=55898C-49443(r=0.9997),線性范圍為2.01 ~20.12 μg/mL。

    2.1.5 精密度實驗 精密吸取標準溶液20 μL,在一天內(nèi)連續(xù)進樣測定5次,以及連續(xù)5 d進樣測定,計算得綠原酸和木犀草苷的日內(nèi)RSD分別為1.32%和1.79%,日間RSD分別為 1.74%和 2.33%。

    2.1.6 回收率實驗 精密稱取已知綠原酸和木犀草苷量的提取物樣品適量,置10 mL量瓶內(nèi),分別精密加入相當于已知對照品量80%、100%、120%的綠原酸、木犀草苷對照品,加入50%甲醇溶解、搖勻,濾過。將續(xù)濾液適當稀釋后HPLC進樣測定綠原酸和木犀草苷的量,計算得綠原酸和木犀草苷的平均回收率分別為103.29%和102.18%,RSD分別為 1.21%和 1.99%。

    2.2 乙醇回流提取法 準確稱取干燥的金銀花藥材50 g,加入一定量的乙醇,浸泡0.5 h后,選用L9(34)正交表進行試驗,因素與水平見表1。藥材回流提取2次后,合并每次實驗的金銀花提取液,過濾后減壓濃縮、真空干燥后進行HPLC測定,計算綠原酸與木犀草苷的轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表2。

    表1 因素水平

    表2 正交試驗安排及結(jié)果

    以綠原酸轉(zhuǎn)移率為指標直觀分析(見表3),影響因素順序為A>B>C,即含乙醇量>乙醇用量>回流時間;最佳工藝為A1B1C1,即60%乙醇8倍量,回流提取2次,每次0.5 h。方差分析結(jié)果表明3個因素對綠原酸的提取效果均無顯著性影響。

    表3 綠原酸轉(zhuǎn)移率直觀分析

    以木犀草苷轉(zhuǎn)移率為指標直觀分析(見表4),影響因素順序為C>A>B,即回流時間>含乙醇量>乙醇用量;最佳工藝為A1B2C1,即60%乙醇10倍量,回流提取2次,每次0.5 h。方差分析結(jié)果表明3個因素對木犀草苷的提取效果均無顯著性影響(P>0.05)。

    為兼顧綠原酸和木犀草苷的提取效果,結(jié)合兩者的轉(zhuǎn)移率計算,總轉(zhuǎn)移率評分=綠原酸轉(zhuǎn)移率/最高值×50+木犀草苷轉(zhuǎn)移率/最高值×50,以總轉(zhuǎn)移率評分為指標來對正交試驗結(jié)果進行分析(見表5),則影響因素順序為C>A>B,即回流時間>含乙醇量>乙醇用量;最佳工藝為A1B1C1,即60%乙醇8倍量,回流提取2次,每次0.5h。方差分析結(jié)果表明3個因素對兩成分的總提取效果均無顯著性影響(P>0.05)。

    表4 木犀草苷轉(zhuǎn)移率直觀分析

    表5 總轉(zhuǎn)移率評分直觀分析

    2.3 乙醇超聲提取法 準確稱取干燥的金銀花藥材50 g,加入一定量的乙醇,浸泡0.5 h后,選用L9(34)正交表進行試驗,因素與水平表見表6。藥材提取后,合并每次實驗的金銀花提取液,過濾后減壓濃縮、真空干燥后進行HPLC測定,計算綠原酸與木犀草苷的轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表7。

    以綠原酸轉(zhuǎn)移率為指標直觀分析(見表8),影響因素順序為A>B>D>C,即含乙醇量>超聲功率>超聲時間>乙醇用量;最佳工藝為A1B2C3D2,即60%乙醇12倍量,超聲功率240W,超聲1.0h。以離差平方和最小的因素項(C項)為誤差項進行方差分析,結(jié)果表明A、B、D 3個因素對綠原酸的提取效果均無顯著性影響(P>0.05)。

    表6 因素水平表

    表7 正交試驗安排及結(jié)果

    以木犀草苷轉(zhuǎn)移率為指標直觀分析(見表9),影響因素順序為B>A>D>C,即超聲功率>含乙醇量>超聲時間>乙醇用量;最佳工藝為A1B2C1D2,即60%乙醇8倍量,超聲功率240W,超聲1.0h。以離差平方和最小的因素項(C項)為誤差項進行方差分析,結(jié)果表明A、B、D 3個因素對木犀草苷的提取效果均無顯著性影響(P>0.05)。

    表8 綠原酸轉(zhuǎn)移率直觀分析

    表9 木犀草苷轉(zhuǎn)移率直觀分析

    以總轉(zhuǎn)移率評分為指標直觀分析(見表10),影響因素順序為B>A>D>C,即含乙醇量>超聲功率>超聲時間>乙醇用量;最佳工藝為A1B2C3D2,即60%乙醇12倍量,超聲功率240 W,超聲1.0 h。以離差平方和最小的因素項(C項)為誤差項進行方差分析,結(jié)果表明A、B、D 3個因素對兩者的總提取效果均無顯著性影響(P>0.05)。

    表10 總轉(zhuǎn)移率評分直觀分析

    2.4 不同工藝的比較 準確稱取干燥的金銀花藥材50 g,按上述兩種提取方法的最佳工藝進行提取,制備樣品并進行HPLC測定,計算綠原酸與木犀草苷的轉(zhuǎn)移率,結(jié)果見表11。

    表11 幾種最佳工藝提取效果的比較(n=3)

    由上表可見,以綠原酸轉(zhuǎn)移率為指標,乙醇回流法顯著優(yōu)于超聲法;若以木犀草苷轉(zhuǎn)移率為指標,則超聲法略優(yōu)于回流法。同一提取方法,評價指標不同,得到的最佳工藝也有差異,對兩種成分的提取效果略有不同。但以總轉(zhuǎn)移率評分為指標綜合評價的結(jié)果與以綠原酸轉(zhuǎn)移率為指標一致。

    3 討論

    本研究建立的HPLC方法可用于金銀花中綠原酸和木犀草苷的同時測定,且含量均符合《中國藥典》的要求,是對《中國藥典》方法的一個補充。

    木犀草苷是金銀花用以區(qū)別山銀花的特征性成分,具有很強的抗呼吸道合胞體病毒活性,也是其抗菌抗病毒有效成分之一[8]。因此,在金銀花的提取工藝研究中,不能僅以單一成分為指標進行評價,否則不能反映兩種甚至多種成分的綜合提取效果,應結(jié)合藥理學研究結(jié)果,選擇合理的指標性成分,才能充分保證提取工藝的可行性和提取物的藥效[9-10]。

    實驗結(jié)果表明,以綠原酸轉(zhuǎn)移率為指標,回流法顯著優(yōu)于超聲法;以木犀草苷轉(zhuǎn)移率為指標,則超聲法略優(yōu)于煎煮法。綜合指標評價結(jié)果與以綠原酸為指標一致,可能與木犀草苷的提取轉(zhuǎn)移率偏低,對總轉(zhuǎn)移率評分的貢獻相對較小有關。另外,本研究中測定的是固體提取物中有效成分的轉(zhuǎn)移率,木犀草苷的轉(zhuǎn)移率偏低且遠低于在提取液中的轉(zhuǎn)移率,可能與其濃縮干燥過程中的穩(wěn)定性有關。如何增加木犀草苷的提取率及改善其穩(wěn)定性,充分保證金銀花提取物的質(zhì)量,還有待進一步研究。

    [1]王天志,李永梅.金銀花的研究進展[J].華西藥學雜志,2000,15(4):292-298.

    [2]Li Xiaoqin,Sun Xiaohong,Cai Shuang,et al.Investigation on the chemical constituents and variation of the flower buds of Lonicera species by UPLC-ESI-MS/MS and principle component ana lysis[J].Acta Pharm Sin.2009,44(8):895-904.

    [3]Chai Xingyun,Li Songlin,Li Ping.Quality evaluation of Flos Lonicerae through a simultaneous determination of seven saponins by HPLC with ELSD[J].J Chromatogr A,2005,1070(1-2):43-48.

    [4]國家藥典委員會.中化人民共和國藥典:2005年版一部[S].北京:化學工業(yè)出版社,2005:152-153.

    [5]國家藥典委員會.中化人民共和國藥典:2010年版一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:205-206.

    [6]劉祥蘭,劉重芳,張 英,等.金銀花中綠原酸提取工藝的比較和優(yōu)化研究[J].中成藥,2000,22(6):402-404.

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