響應(yīng)面分析法優(yōu)化川芎藁本內(nèi)酯提取工藝的研究

朱家校， 何 偉， 李 勇， 姚 曦

(廣東藥學(xué)院藥物研究所廣東省藥物新劑型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006)

川芎為傘形科藁本屬植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。其性溫，味辛、微苦，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛之功效。主治血瘀氣滯所致月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉，肝郁氣滯而致血行不暢的胸脅疼痛、頭痛、風(fēng)寒濕痹、跌打腫痛等疾?。?］。川芎主要成分是藁本內(nèi)酯、川芎嗪、阿魏酸等［2-4］，具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化、抗血栓、抗心肌缺血、舒張血管、抑制神經(jīng)元變性等藥理作用［5-10］。

響應(yīng)面分析法(Response Surface Methology，RSM)是一種優(yōu)化工藝條件的方法，1951年Box和Wilsond首次用于確定各因素及其交互作用在工藝過(guò)程中對(duì)響應(yīng)值的影響［11］。在實(shí)驗(yàn)條件尋優(yōu)過(guò)程中，響應(yīng)面分析法可以連續(xù)地對(duì)實(shí)驗(yàn)的各個(gè)水平進(jìn)行分析，本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法，以藁本內(nèi)酯量為指標(biāo)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，考察川芎回流提取，提取溫度、含乙醇量、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響，優(yōu)選川芎藁本內(nèi)酯的最佳提取工藝。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex ultimate 3000高效液相色譜儀(光電二極管陣列檢測(cè)器、Chromeleon色譜工作站);BS224S型電子分析天平(北京sartorius);HWS-12電熱恒溫水浴鍋(普瑞賽斯儀器有限公司)。

1.2 試藥 川芎藥材(批號(hào):080401)購(gòu)自廣州致信中藥飲片有限公司;藁本內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào):0817-9502，供定量測(cè)定用)購(gòu)自天津一方科技有限公司;試劑:甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 藁本內(nèi)酯測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱:Dikma Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相∶甲醇-水(77 ∶23);檢測(cè)波長(zhǎng):324 nm;柱溫:30 ℃;體積流量:1.0 mL/min，進(jìn)樣量:10 μL;理論塔板數(shù)按藁本內(nèi)酯計(jì)不應(yīng)低于5000。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取川芎藥材粗粉10.0 g，平行2份，置圓底燒瓶中，準(zhǔn)確加入一定量和一定濃度的乙醇，回流提取2次，每次一定時(shí)間，濾過(guò)，合并濾液，定容，搖勻，精密吸取5 mL，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱(chēng)取藁本內(nèi)酯對(duì)照品20 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，作為對(duì)照品貯備液。精密吸取對(duì)照品貯備液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，作為對(duì)照品溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液2、3、5、10、15、20 μL 注入液相色譜儀中，測(cè)定藁本內(nèi)酯色譜峰面積，以藁本內(nèi)酯微克數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，得回歸方程為:Y=41.298 X-0.1269，r=0.9999。表明藁本內(nèi)酯在 0.1600 μg ～1.600 μg 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.4 定量測(cè)定 精密吸取供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀中，測(cè)定藁本內(nèi)酯色譜峰面積，計(jì)算藁本內(nèi)酯量。

2.2 單因素試驗(yàn)確定主要影響因素及范圍

2.2.1 提取溶劑的影響 固定提取溫度為80℃，提取時(shí)間為2.0 h，料液比為1∶25，分別以水、甲醇、乙醇、丙酮為提取溶劑，加熱回流提取，以觀察不同溶劑對(duì)藁本內(nèi)酯提取效果的影響(見(jiàn)圖1，n=3)。從圖1結(jié)果可以看出，當(dāng)用甲醇或乙醇作為提取溶劑時(shí)，藁本內(nèi)酯的提取量較高。由于甲醇具有一定的毒性，故選用乙醇作為提取溶劑。

2.2.2 提取溫度的影響 固定提取時(shí)間為2.0 h，料液比為1∶25，含乙醇量為70%，改變提取溫度，以觀察其對(duì)藁本內(nèi)酯的提取效果的影響(見(jiàn)圖2-A，n=3)。從圖2-A結(jié)果可以看出，在一定溫度范圍內(nèi)，隨提取溫度的升高，藁本內(nèi)酯的提取量逐漸增加。當(dāng)提取溫度超過(guò)80℃時(shí)，藁本內(nèi)酯提取量變化不明顯。因此，將響應(yīng)面試驗(yàn)中的提取溫度設(shè)定在70℃ ～90℃之間。

圖1 不同提取溶劑對(duì)藁本內(nèi)酯提取量的影響

2.2.3 提取時(shí)間的影響 固定提取溫度為80℃，料液比為1∶25，含乙醇量為70%，改變提取時(shí)間，以觀察其對(duì)藁本內(nèi)酯的提取效果的影響(見(jiàn)圖2-B，n=3)。從圖2-B結(jié)果可以看出，提取時(shí)間過(guò)短，藁本內(nèi)酯提取不完全;提取時(shí)間超過(guò)2 h后，藁本內(nèi)酯提取量的變化不明顯。因此，將響應(yīng)面試驗(yàn)中的提取時(shí)間設(shè)定在1.5～2.5 h之間。

2.2.4 含乙醇量的影響 固定提取時(shí)間為2.0 h，提取溫度為80℃，料液比為1∶25，改變含乙醇量，以觀察其對(duì)藁本內(nèi)酯提取效果的影響(見(jiàn)圖2-C，n=3)。從圖2-C結(jié)果可以看出，含乙醇量升高，藁本內(nèi)酯提取量逐漸增加，70%乙醇提取量最高，但當(dāng)含乙醇量繼續(xù)增大時(shí)，藁本內(nèi)酯提取量明顯減少。因此，將響應(yīng)面試驗(yàn)中的含乙醇量設(shè)定在50% ～90%之間。

圖2 不同試驗(yàn)因素對(duì)藁本內(nèi)酯提取量的影響

2.2.5 料液比的影響 固定提取時(shí)間為2.0 h，提取溫度為80℃，含乙醇量為70%，改變料液比，以觀察其對(duì)藁本內(nèi)酯的提取效果的影響(見(jiàn)圖2-D，n=3)。從圖2-D可以看出，料液比為1∶25時(shí)，藁本內(nèi)酯提取量最高，料液比對(duì)藁本內(nèi)酯提取效果的影響程度比其他因素要小，為了減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，所以提取工藝中料液比固定為1∶25。

2.3 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝條件

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)的原理和單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取進(jìn)取溫度、含乙醇量和提取時(shí)間3個(gè)對(duì)藁本內(nèi)酯提取量影響較大的因素，進(jìn)行3因素3水平(共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，3個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)面試驗(yàn)，應(yīng)用Design-Expert7.16軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，確定川芎中藁本內(nèi)酯的最佳提取條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表1、2。

2.3.2 模型擬合與顯著性檢驗(yàn) 將所得數(shù)據(jù)采用Design-Expert7.16軟件對(duì)表2中進(jìn)行數(shù)據(jù)進(jìn)行二項(xiàng)式擬合回歸，得到以藁本內(nèi)酯提取量(Y)為響應(yīng)值，3個(gè)參數(shù)為自變量的二次回歸模型方程為:

表1 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼表

為檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)川芎藁本內(nèi)酯提取的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，由表3可知，模型的P值小于0.01，表明二次方程擬合高度顯著，失擬項(xiàng)F值為12.02，顯示失擬項(xiàng)相對(duì)絕對(duì)誤差不顯著，而不顯著的失擬項(xiàng)才合理。提取溫度及提取時(shí)間對(duì)藁本內(nèi)酯的提取量有顯著影響;二次項(xiàng)X22影響極顯著;交互項(xiàng)按影響大小排序依次為X1X2、X2X3、X1X3。由圖3可知，隨含乙醇量的增加，藁本內(nèi)酯的提取量先升高后降低，說(shuō)明藁本內(nèi)酯具有一定的極性;提取時(shí)間的延長(zhǎng)，藁本內(nèi)酯的提取量先升高后降低，藁本內(nèi)酯在較高溫度的條件下不穩(wěn)定。剔除不顯著項(xiàng)后即得回歸方程式(2)。簡(jiǎn)化的方程R=0.9608，降幅較小，說(shuō)明此方程的可信度高。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 川芎藁本內(nèi)酯提取回歸模型方差分析

2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)回歸模型預(yù)測(cè)的川芎藁本內(nèi)酯提取的最佳工藝條件為:提取溫度88.87℃，含乙醇量70.72%，提取時(shí)間2.3 h，料液比1 ∶25，提取2 次，預(yù)測(cè)值為6.8696 mg/g?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將川芎藁本內(nèi)酯提取的提取條件在回歸方程得到的理論值基礎(chǔ)上修正為:提取溫度 89℃，含乙醇量71%，提取時(shí)間2.3 h，料液比1∶25，提取2次，采用此工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=3)，藁本內(nèi)酯提取量分別為 6.84，6.83，6.83mg/g，均與預(yù)測(cè)值相差不大，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所建模型得到的工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

圖3 各因素兩兩交互作用對(duì)藁本內(nèi)酯提取量影響的響應(yīng)面圖

3 討論

傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)往往采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)［12］，尋求最佳的因素水平組合，即用線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，試驗(yàn)次數(shù)雖少，但不能在設(shè)定的整個(gè)區(qū)域上找到因素和響應(yīng)值之間的一個(gè)明確的函數(shù)表達(dá)式，從而無(wú)法找到整個(gè)區(qū)域上的因素的最佳組合和響應(yīng)的最優(yōu)值。響應(yīng)面分析法克服了正交設(shè)計(jì)和均勻設(shè)計(jì)的缺陷，通過(guò)采用非線性擬合的中心組合-效應(yīng)面法研究各因素間相互作用的一種回歸分析方法。響應(yīng)面分析法亦有其局限性:設(shè)計(jì)的試驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)包括最佳的實(shí)驗(yàn)條件，如果實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的選取不當(dāng)，應(yīng)用響應(yīng)面分析法也不能得到很好的優(yōu)化結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)首先以單因素試驗(yàn)確定主要影響因素及范圍，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法考察藥材的提取溫度、含乙醇量、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)提取效果的影響，優(yōu)選藁本內(nèi)酯的最佳提取工藝，有效地改善了提取效果，具有較大的實(shí)用價(jià)值。

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