腺苷誘導(dǎo)人食管癌EC109細(xì)胞凋亡及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子機(jī)制

韋碧柳，李國(guó)平，蒲澤錦，黃官友，馮家琳，葉艷清，吳靈飛

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院1.消化內(nèi)科，2.婦產(chǎn)科，3.信息科，廣東 汕頭 515041)

腺苷是人體內(nèi)重要的生物信號(hào)分子，正常情況下維持在極低濃度水平，通過(guò)不同的腺苷受體發(fā)揮生理調(diào)節(jié)功能［1］。然而，體外高濃度腺苷卻可通過(guò)線粒體途徑［2］或其死亡受體途徑［3］等不同機(jī)制誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。已有研究表明，腺苷可誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡［4］，其機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑有關(guān)［5］。雖然食管癌 EC109細(xì)胞和肝癌HepG2細(xì)胞均屬于上皮類(lèi)型細(xì)胞，但兩種細(xì)胞來(lái)源于不同的上皮，腺苷是否亦可通過(guò)此途徑誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在觀察腺苷對(duì)人食管癌EC109細(xì)胞凋亡的作用，并探討其與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

腺苷購(gòu)自美國(guó)Amerco公司。DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Clark Bio公司;山羊抗人葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)抗體、小鼠抗人胱天蛋白酶4抗體、兔抗人轉(zhuǎn)錄因子CHOP抗體、兔抗人胱天蛋白酶3抗體和小鼠抗人β肌動(dòng)蛋白抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司;蛋白酶抑制劑 PMSF、裂解液、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)、生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(二抗)和生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體(二抗)均購(gòu)自Sigma公司;Alexa Flour標(biāo)記的羊抗兔 IgG抗體(熒光標(biāo)記二抗)購(gòu)自Invitrogen公司;親和素生物素辣根過(guò)氧化物復(fù)合物(avidin biotin horseradish peroxidase complex，ABC)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Vector Laboratories公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Pierce公司;TUNEL試劑盒購(gòu)自Promega公司;硝酸纖維素膜購(gòu)自Millipore公司。熒光顯微鏡BX51(日本Olympus公司);蛋白電泳與轉(zhuǎn)膜裝置Mini ProteinⅢ和紫外分光光度計(jì)smartspecTM 3000(美國(guó)Bio-Rad公司);酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(芬蘭Thermo Fisher科技公司);低溫高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝科學(xué)儀器研究所)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

EC109細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，3 d傳代1次，在37℃，95%濕度和5%CO2的條件下培養(yǎng)，12 h后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

時(shí)效觀察:每孔加入100 μl EC109細(xì)胞懸液(含1×105細(xì)胞)至96孔板中，培養(yǎng)12 h后棄原培養(yǎng)基，加入含腺苷終濃度2 mmol·L-1培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24，36，48和72 h，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔及調(diào)零孔;隨后加20 μl MTT 5 g·L-1，作用 4 h 后棄培養(yǎng)基，加DMSO 150 μl，避光振蕩10 min，用酶標(biāo)儀490 nm 處檢測(cè)吸光度(A)，觀察時(shí)效關(guān)系。另取96板，同前處理細(xì)胞，12 h 后加腺苷 0.5，1，2 和 4 mmol·L-1孵育培養(yǎng)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔及調(diào)零孔，36 h后加20 μl MTT 5 g·L-1，后續(xù)處理同時(shí)效觀察實(shí)驗(yàn)，觀察量效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.4 TUNEL法測(cè)定細(xì)胞凋亡

把細(xì)胞接種于放置有蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)12 h 后，分對(duì)照組和腺苷 0.5，1，2 和 4 mmol·L-1組，培養(yǎng)36 h。PBS洗2次，每次5 min，其余步驟按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。每張玻片400倍顯微鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)并計(jì)數(shù)。凋亡細(xì)胞胞核呈褐色，正常細(xì)胞胞核呈淡藍(lán)色。細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù) /總細(xì)胞數(shù) ×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)及亞細(xì)胞定位

細(xì)胞爬片至6孔板，培養(yǎng)12 h，分別加入正常培養(yǎng)基和含腺苷終濃度為2 mmol·L-1的培養(yǎng)基，孵育36 h。棄培養(yǎng)基，室溫下用4%多聚甲醛固定6 min，0.2%Triton-X 100 穿孔5 min，2%BSA 封閉30 min。分別加入抗GRP78，胱天蛋白酶4，胱天蛋白酶 3，CHOP和 NF-κB及 β 肌動(dòng)蛋白抗體(1∶100)，4℃過(guò)夜，PBS洗3次。加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗(1∶50)，室溫60 min，DAPI染核10 min，進(jìn)行熒光拍照。根據(jù)熒光強(qiáng)度調(diào)節(jié)曝光時(shí)間(同組曝光時(shí)間相同)。應(yīng)用SimplePCI圖像軟件將胞漿和胞核熒光圖像進(jìn)行融合，與正常對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比并分別做好標(biāo)記，熒光顆粒即為陽(yáng)性表達(dá)，觀察該蛋白是否出現(xiàn)表達(dá)并進(jìn)行亞細(xì)胞定位［5-7］。

1.6 Western印跡法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)

取5瓶25cm2長(zhǎng)滿(mǎn)80%的EC109細(xì)胞，分對(duì)照組和藥物處理組，分別加腺苷0～4.0 mmol·L-1的培養(yǎng)基。孵育36 h，棄培養(yǎng)基，冷PBS洗3次。加含蛋白酶抑制劑PMSF的裂解液150 μl，冰上作用20 min。收集細(xì)胞，超聲裂解30循環(huán)。4℃，13400×g離心10 min，收集上清，存于-80℃。取等量蛋白(100 μg)上樣，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕式法轉(zhuǎn)膜。分別加入抗GRP78、胱天蛋白酶 4、胱天蛋白酶 3、CHOP、NF-κB和 β 肌動(dòng)蛋白抗體(1∶400)，4℃ 過(guò)夜，TBS洗膜3次;加入相應(yīng)二抗(1∶4000)孵育1～2 h，TBS洗膜3次;使用ABC試劑盒混合液(A液∶B液∶PBS=1∶1∶500)孵育 30 min，再次 TBS洗膜 3 次，ECL法發(fā)光，暗室曝光。采用凝膠分析軟件Quantity One(美國(guó)Bio-Rad公司)進(jìn)行半定量分析，各電泳條帶積分吸光度(integrated absorbance，IA)與內(nèi)參照β肌動(dòng)蛋白IA的比值表示各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 腺苷對(duì)EC109細(xì)胞存活的影響

腺苷 2 mmol·L-1與 EC109 細(xì)胞作用 24，36，48和72 h，細(xì)胞存活率呈時(shí)間依賴(lài)性下降(r=0.9192，P＜0.01)(圖1A)。72 h時(shí)細(xì)胞存活率最低，但由于干擾因素較多，除細(xì)胞凋亡外還伴有部分壞死，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用36 h作為藥效觀察時(shí)間。腺苷0.5，1，2 和4 mmol·L-1處理 EC109 細(xì)胞 36 h，隨藥物濃度增加，細(xì)胞存活率呈濃度依賴(lài)性降低(r=0.8252，P ＜0.01)(圖1B)。

2.2 腺苷對(duì)EC109細(xì)胞凋亡的影響

腺苷 0.5，1，2 和 4 mmol·L-1處理 EC109 細(xì)胞36 h，所有腺苷處理組均出現(xiàn)凋亡細(xì)胞(圖2)。400倍顯微鏡下，每組隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)并計(jì)數(shù)。由表1結(jié)果表明，隨腺苷濃度升高，細(xì)胞凋亡率明顯升高(r=0.874，P ＜0.05)。

圖1 腺苷對(duì)EC109細(xì)胞存活的影響.A:腺苷2 mmol·L-1與EC109細(xì)胞作用不同時(shí)間;B:不同濃度腺苷與EC109細(xì)胞作用36 h.＊＊P ＜0.01，與正常對(duì)照組比較.Fig.1 Effect of adenosine on EC109 cell survival.

圖2 腺苷與EC109細(xì)胞孵育36 h對(duì)細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL ×400).A:正常對(duì)照;B，C，D 和E:腺苷0.5，1，2和4 mmol·L-1.箭頭所指為凋亡細(xì)胞.Fig.2 Effect of adenosine on apoptosis of EC109 cells after cultured for 36 h(TUNEL ×400).

表1 腺苷對(duì)EC109細(xì)胞凋亡的影響Tab.1 Effect of adenosine on apoptosis of EC109 cells

2.3 腺苷對(duì)EC109細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)及亞細(xì)胞定位的影響

圖3 腺苷對(duì)EC109細(xì)胞葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)(A)，胱天蛋白酶4(B)，胱天蛋白酶3(C)，轉(zhuǎn)錄因子CHOP(D)表達(dá)與亞細(xì)胞定位的影響 (免疫熒光，×1000).1.正常對(duì)照組;2.腺苷處理組，腺苷2 mmol·L-1作用細(xì)胞36 h.Fig.3 Effect of adenosine on expression and subcellular locations of glucose regulated protein 78(GRP78)(A)，caspase4(B)，caspase3(C)and CHOP(D)in EC109cells after cultured for 36 h(Immunofluorescence staining ×1000).

由圖3所示，腺苷2 mmol·L-1與EC109細(xì)胞作用36 h，對(duì)照組細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)GRP78的表達(dá)，腺苷處理組表達(dá)增多;胱天蛋白酶4，胱天蛋白酶3和CHOP在對(duì)照組細(xì)胞胞漿中無(wú)表達(dá)，而腺苷處理組胞漿和細(xì)胞核均出現(xiàn)表達(dá);表明胱天蛋白酶4，胱天蛋白酶3和CHOP蛋白發(fā)生核移位。由此提示，腺苷與EC109細(xì)胞作用后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路被激活。

2.4 腺苷對(duì)EC109細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)

Western印跡法檢測(cè)結(jié)果(圖4，表2)表明，腺苷0.5，1，2 和 4 mmol·L-1與 EC109 細(xì)胞作用 36 h，GRP78、胱天蛋白酶 4、胱天蛋白酶 3、CHOP和NF-κB蛋白表達(dá)均較對(duì)照組升高(P＜0.05);隨腺苷濃度升高，上述蛋白的表達(dá)均呈濃度依賴(lài)性增加(rGRP78=0.9471，r胱天蛋白酶4=0.8977，r胱天蛋白酶3=0.968，rCHOP=0.9762，rNF-κB=0.9471);提示腺苷可激活EC109細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激死亡通路。

圖4 腺苷與EC109細(xì)胞作用36 h對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響.泳道1～5分別為腺苷0，0.5，1，2和4 mmol·L-1組.Fig.4 Effect of adenosine on expressions of endoplasmic reticulum stressrelated proteinsin EC109 cellsafter cultured for 36 h.

3 討論

Maaser等［8］報(bào)道，腺苷可抑制食管癌 Kyse-140細(xì)胞生長(zhǎng)，但其機(jī)制尚未闡明。本研究結(jié)果表明，腺苷能降低食管癌EC109細(xì)胞的存活率，并呈時(shí)間和濃度依賴(lài)性。另外，腺苷亦可濃度依賴(lài)性地促進(jìn)EC109細(xì)胞凋亡。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成及合成后折疊和聚集的場(chǎng)所，是調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)及細(xì)胞鈣水平的部位。在多種生理或病理?xiàng)l件下，當(dāng)細(xì)胞受到藥物、射線導(dǎo)致基因損傷等各種刺激時(shí)會(huì)引起未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)聚集，稱(chēng)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以分為2個(gè)階段，早期的非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)［9］及晚期的誘導(dǎo)凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)UPR以保護(hù)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引起的細(xì)胞損傷，恢復(fù)細(xì)胞功能。一旦損傷過(guò)于嚴(yán)重，內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定不能及時(shí)得到恢復(fù)，則內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)由促生存向促凋亡方向轉(zhuǎn)換。這些作用既能為受損細(xì)胞提供修復(fù)機(jī)會(huì)，又能最大限度地清除過(guò)度損傷的細(xì)胞，以維護(hù)機(jī)體的生理平衡和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定［10-11］。UPR主要由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶 GRP78蛋白所介導(dǎo)。本研究用免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果表明，正常對(duì)照組EC109細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)GRP78的表達(dá)，腺苷處理組表達(dá)增多;Western印跡法檢測(cè)亦發(fā)現(xiàn)，腺苷處理EC109細(xì)胞后GRP78的表達(dá)亦較正常對(duì)照組明顯增加，并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性;由此表明，經(jīng)腺苷處理后EC109細(xì)胞發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。

一般認(rèn)為，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過(guò)胱天蛋白酶4及CHOP等途徑激活下游基因，最終通過(guò)效應(yīng)胱天蛋白酶3而引發(fā)細(xì)胞凋亡。CHOP也稱(chēng)為GADD153，是一種核轉(zhuǎn)錄因子，可抑制Bcl-2的啟動(dòng)，在正常的細(xì)胞中低表達(dá)［12］。CHOP/GADD153基因可因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而激活，并伴mRNA及蛋白水平表達(dá)升高［13］。據(jù)報(bào)道，UPR 可上調(diào) CHOP/GADDI53，通過(guò)減少Bcl-2蛋白表達(dá)而提高線粒體對(duì)促凋亡因子的敏感性［14-15］。CHOP通過(guò)活化胱天蛋白酶9前體、啟動(dòng)胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16］。胱天蛋白酶4則可直接活化下游效應(yīng)基因胱天蛋白酶3觸發(fā)凋亡［17-18］。本研究通過(guò)免疫熒光法檢測(cè)，觀察到腺苷處理后胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶3及CHOP均明顯增加，并發(fā)現(xiàn)從胞漿轉(zhuǎn)入胞核;蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)亦發(fā)現(xiàn)，胱天蛋白酶4、胱天蛋白酶3及CHOP的表達(dá)均隨腺苷濃度的增加而增加。據(jù)報(bào)道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)激活的CHOP/GADD153表達(dá)增加，而且其表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡率成正比［19］。本研究亦觀察到腺苷處理后EC109細(xì)胞隨藥物濃度升高而凋亡率增加，與上述結(jié)果一致，表明CHOP、胱天蛋白酶4和胱天蛋白酶3活化即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路參與了腺苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程。已有研究報(bào)道腺苷對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖亦有抑制作用，而且與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路有關(guān)［5］。本研究提示，腺苷對(duì)食管鱗狀上皮癌細(xì)胞亦有類(lèi)似作用，這擴(kuò)大了對(duì)腺苷藥物作用范圍的認(rèn)識(shí)。

表2 腺苷與EC109細(xì)胞作用36 h對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Tab.2 Effect of adenosine on expressions of endoplasmic reticulum stress related proteins in EC109 cells after cultured for 36 h

NF-κB在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡方面的作用是復(fù)雜的，有些研究顯示其促進(jìn)細(xì)胞生存［20-21］，有些則提示其促進(jìn)細(xì)胞凋亡［22］。本研究結(jié)果表明，腺苷在引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)NF-κB被明顯激活，并且呈濃度依賴(lài)性，進(jìn)一步提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路參與了腺苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

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