單一試劑連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定α-L-巖藻糖苷酶

王祖蓮

（石屏縣人民醫(yī)院，云南 石屏 652200）

AFU是1種溶酶體酸性水解酶，分類(lèi)名為α-L-巖藻糖苷水解酶 （EC 3.2.1.51）[1]。自從1980年法國(guó)學(xué)者Deugnier等報(bào)道原發(fā)性肝癌（PHC）的病人血清AFU活性升高，并經(jīng)國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)，已確認(rèn)AFU是PHC高靈敏的特異性標(biāo)記物。建立1種方便適用的AFU檢測(cè)方法尤為重要。

用于AFU測(cè)定的方法主要有2類(lèi)：（1） 以4-甲基傘型酮-α-L-巖藻吡喃糖苷為底物的熒光法[2]。（2） 以對(duì)硝基苯-α-L-巖藻糖苷為底物的比色法[3]。前者檢測(cè)靈敏度高，適用于微量樣品及低活性樣品的檢測(cè)，但此法步驟繁瑣，又需要熒光光度計(jì)，常規(guī)應(yīng)用受到限制。后者是目前臨床實(shí)驗(yàn)室主要采用的方法，在酸性時(shí)AFU水解對(duì)硝基苯-α-L-巖藻糖苷產(chǎn)生對(duì)硝基酚，水解反應(yīng)完成后，需用堿性緩沖液終止反應(yīng)并顯色，此測(cè)定原理決定了測(cè)定為2點(diǎn)終點(diǎn)法，且需設(shè)樣品空白以去除本底的干擾，操作較繁瑣。

隨著新合成底物2-氯-4-硝基苯-α-L-巖藻糖苷（CNP-AFU）的出現(xiàn)，以此為底物的速率法也叫連續(xù)檢測(cè)法，近年來(lái)普遍應(yīng)用于臨床實(shí)驗(yàn)。CNP-AFU速率法采用單一試劑，有較高的靈敏度和精密度，較強(qiáng)的抗干擾性，線(xiàn)性反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，試劑穩(wěn)定性好。本實(shí)驗(yàn)采用了此種方法原理，研究了一些檢測(cè)條件，建立了單一試劑連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定α-L-巖藻糖苷酶。

材料和方法 島津UV-2401PC分光光度計(jì)，Cole Parmer pH計(jì)，CB171半自動(dòng)生化儀，HITACHI 7060全自動(dòng)生化儀。

試劑：基質(zhì)緩沖液：0.1MMES-NaOH（以下簡(jiǎn)稱(chēng)MES緩沖液）：無(wú)水2-N-嗎啉乙磺酸（MES， C6H13NO4S， MW=195.2） 19.52g， NaCl 8.5g，NaN30.3g，蒸餾水溶解，用0.1MNaOH溶液調(diào)pH為4.8，置于冰箱保存。CNP標(biāo)準(zhǔn)溶液：5.0mmol/LCNP標(biāo)準(zhǔn)溶液，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0434g 2-氯-4-硝基苯酚（CNP，C6H4ClNO3，MW=173.56，上海二醫(yī)大化學(xué)教研室提供），用基質(zhì)緩沖液溶解，配成50ml 5.0mmol/L標(biāo)準(zhǔn)液，置于棕色瓶放冰箱保存?；|(zhì)溶液 （1.2g/L）：準(zhǔn)確稱(chēng)取 CNP-AFU（C12H14ClNO7，MW=319.75，上海二醫(yī)大化學(xué)教研室提供）0.3g，用MES基質(zhì)緩沖液溶解，并加至250毫升容量瓶刻度，置于棕色瓶瓶放冰箱保存。

樣本 健康人血清（正常組）；PHC患者血清（病理組）。干擾物質(zhì) 抗壞血酸、膽紅素、血紅蛋白。

方法原理 用2-氯-4-硝基苯-α-L-巖藻糖苷在AFU催化下，分解成α-L-巖藻糖苷和2-氯-4-硝基苯酚，37℃時(shí)在波長(zhǎng)405nm處可使吸光度值增加，連續(xù)監(jiān)測(cè)吸光度值的變化，可計(jì)算出樣品中AFU的活性。測(cè)試參數(shù)：溫度為37℃；波長(zhǎng)λ=405nm，試劑樣品比10∶1，延遲時(shí)間60s，測(cè)定時(shí)間120s。使用如公式計(jì)算：

注：ΔA/min：每分鐘吸光度變化值；106：將mol換算成μmol；SV：樣本體積；TV：反應(yīng)總體積；ε：產(chǎn)物CNP的摩爾吸光系數(shù)；p：比色杯光徑。

結(jié) 果 1.反應(yīng)體系緩沖液選擇 分別以pH5.0，0.1mol/L的檸檬酸、醋酸、EMS緩沖液配制相同濃度底物基質(zhì)液，測(cè)定同一人血清樣品。在酶促反應(yīng)經(jīng)時(shí)曲線(xiàn)和反應(yīng)線(xiàn)性穩(wěn)定性方面，MES緩沖液為最佳（見(jiàn)圖1），所以實(shí)驗(yàn)選用MES緩沖體系。

2.CNP摩爾吸光系數(shù)：對(duì)溶于pH4.6～5.4、0.1mol/L的MES緩沖液中的0.05mmol/L CNP，測(cè)定其在波長(zhǎng)405nm的吸光度，得到CNP在不同pH處的摩爾吸光系數(shù)，見(jiàn)圖2。在此pH范圍內(nèi)，CNP在405nm的吸光度是隨著pH增大而增大。

3.最適pH的確定 選擇5種不同pH值（4.6～5.4） 的MES緩沖液，分別配制濃度為5 mmol/L的5種基質(zhì)液。對(duì)同一樣本，分別用這5種基質(zhì)液測(cè)得不同pH下的ΔA/min，再以上面的摩爾吸光系數(shù)算出酶活性，見(jiàn)表1。當(dāng)pH=4.8時(shí)，測(cè)定的酶活性最大，故選擇體系的最適pH是4.8。

表1 同一樣本在不同pH下酶促反應(yīng)及酶活性

4.底物濃度的確定 以pH4.8的EMS緩沖液配制系列底物濃度 （0.05、0.10、0.20、0.30、0.04、0.5mmol/L） 基質(zhì)液，在其他條件不變下，用速率法測(cè)定同樣本AFU酶活性。以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法作圖求出Km值為0.148mmol/L（見(jiàn)圖 2，是斜率除以截距，即0.0035÷0.0237≈0.148）。根據(jù)米曼氏方程，確立本實(shí)驗(yàn)的底物濃度為3.75mmol/L，大約是25倍Km值。

5.酶促反應(yīng)經(jīng)時(shí)曲線(xiàn)觀察及延遲時(shí)間和測(cè)定時(shí)間的確定 以pH4.8、0.1mol/L的EMS緩沖溶液，配成3.75mmol/L的基質(zhì)溶液，在分光光度計(jì)上，取高低2個(gè)不同的樣本（20，60U/L） 連續(xù)掃描800s，觀察酶促反應(yīng)的吸光度變化，從圖4可看出延遲時(shí)間60s后，整個(gè)曲線(xiàn)均勻上升，酶促反應(yīng)線(xiàn)性時(shí)間可達(dá)到10min。因此，根據(jù)大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此速率法的延遲時(shí)間確定為60s，測(cè)定時(shí)間確定為120s。

6.基質(zhì)液穩(wěn)定性 將底物濃度為3.75mmol/L的基質(zhì)溶液，分別置于4℃和37℃避光存放。測(cè)定0、1、3、5、7和15d時(shí)的基質(zhì)液空白吸光度，結(jié)果表明，置于37℃時(shí)，基質(zhì)液只能保存3d；而存放4℃的基質(zhì)液在15d內(nèi)其空白吸光度的變化不大，仍可使用。

7.批內(nèi)重現(xiàn)性 分別對(duì)低、中、高值血清重復(fù)7次測(cè)定，統(tǒng)計(jì)均值，標(biāo)準(zhǔn)查和變異系數(shù)，來(lái)觀察CNPF速率法的批內(nèi)重現(xiàn)性，結(jié)果表明此法批內(nèi)重現(xiàn)性良好（平均cv2.1%），符合臨床診斷試劑的要求（表2）。

表2 CNPF速率法的內(nèi)變變異（n＝7）

8.抗干擾性能 考慮到人體樣本中潛在的干擾物質(zhì)，對(duì)3種可能存在的干擾物質(zhì)進(jìn)行了抗干擾性試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)140mg/L膽紅素、350mg/L血紅蛋白和6g/L抗壞血酸對(duì)AFU酶活性的測(cè)定無(wú)顯著影響。說(shuō)明該法有較強(qiáng)的抗干擾能力。

9.臨床正常和病理組的檢測(cè) 上述建立的AFU速率法在HITACHI7060自動(dòng)分析儀上測(cè)定了120例健康者和35例經(jīng)臨床確診為PHC患者的血清AFU。經(jīng)t檢驗(yàn)p＜0.001，2組有顯著性差異。（見(jiàn)表 3）

表3 正常和病理組的檢測(cè)

討 論 1.速率法相比其他檢測(cè)法具有明顯的優(yōu)點(diǎn)：（1） 新型底物CNP-AFU的出現(xiàn)，是近年來(lái)CNPF速率法迅速得以建立，并逐漸普及于臨床應(yīng)用。因?yàn)镃NPF法所采用的顯色原是CNP，其解離常數(shù)kPa為5.5，接近于AFU的最適pH值。該pH環(huán)境下CNP在405nm處能較好的呈色，無(wú)需做樣品空白，克服了PNPF方法的缺陷，便于自動(dòng)分析儀的應(yīng)用。

（2） 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3種緩沖液體系的篩選，眾多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：醋酸緩沖液對(duì)有些樣品產(chǎn)生副作用，發(fā)現(xiàn)樣品加入醋酸緩沖基質(zhì)液后變混濁，反應(yīng)曲線(xiàn)下滑，無(wú)法檢測(cè)樣品的活性。檸檬酸緩沖液的體系下，酶促反應(yīng)的線(xiàn)性時(shí)間稍短（約為3min），另外檸檬酸緩沖基質(zhì)液的穩(wěn)定性不好。MES為Goods氏系列緩沖劑之一，也是主要的生物緩沖劑。本法選用MES-NaOH緩沖體系，其優(yōu)點(diǎn)在于：①M(fèi)ES緩沖液對(duì)樣品無(wú)副作用；②在MES緩沖體系下，產(chǎn)物CNP的摩爾吸光系數(shù)較高，反之計(jì)算因數(shù)較低，提高了測(cè)試的精密度。③酶促反應(yīng)的線(xiàn)性時(shí)間長(zhǎng)（大于10min），提高了速率法在臨床應(yīng)用的可信度。④本實(shí)驗(yàn)測(cè)得在MES緩沖體系下，AFU酶的Km值為0.148mmol/L，較李興民等人[4]的研究結(jié)果低，使得底物濃度降低，底物的水解速度減少，增加了試劑的穩(wěn)定性。

（3）實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了抗干擾性的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6g/L抗壞血酸、140mg/L膽紅素、350mg/L血紅蛋白對(duì)AFU酶活性的測(cè)定不產(chǎn)生干擾，總體的抗干擾能力與李興民等人[4]報(bào)道建立的方法相當(dāng)。

2.臨床檢測(cè)方面：（1） 研究發(fā)現(xiàn)，溶血的血清樣本明顯提高AFU測(cè)定值，且隨著溶血程度的加深，AFU增高幅度變大?？赡苁羌t細(xì)胞釋放的某些成分的干擾，因此在臨床應(yīng)用中注意。在樣本的收集和處理時(shí)切勿使樣本溶血，收到樣本后應(yīng)盡快分離血清并低溫保存，以免影響測(cè)定結(jié)果。至于溶血使AFU升高的確切機(jī)制尚待進(jìn)一步探索。

（2）由于AFU的各同功酶的活性不一，導(dǎo)致人群中AFU含量的變化幅度較大。實(shí)驗(yàn)表明，大約4%正常人血清AFU活性低于1U/L，但也有個(gè)別樣本超出正常范圍。本文的正常參考值范圍為(21.6±3.94)U/L，比文獻(xiàn)值[4]略低，且范圍略小。有報(bào)道[5]，正常人群中血清AFU活性較低者的白細(xì)胞AFU活性正常；還特別指出，在臨床檢測(cè)中如遇到AFU活性極低者，不要輕易排除（如對(duì)肝癌等診斷） 或肯定（如對(duì)巖藻糖苷貯積病的診斷）某疾病的可能性，最好同時(shí)檢測(cè)被檢測(cè)對(duì)象白細(xì)胞巖藻糖苷酶的活性，再作定論。

（3）本文建立的AFU速率檢測(cè)法經(jīng)過(guò)在臨床上的初步應(yīng)用，PHC病人血清的AFU活性明顯高于健康者，而且研究結(jié)果顯示AFU對(duì)PHC陽(yáng)性率高達(dá)90%。倘若AFU和AFP聯(lián)合檢測(cè)，預(yù)計(jì)對(duì)PHC的檢出率可達(dá)95%以上。

［1］王坤，施前.實(shí)用診斷酶學(xué)[M].第2版.上海：上海醫(yī)科出版社，2000：12.

［2］WOODS.Asensitive flourimetric assayfor α-L-fucosidase[J].ClinchimActa,1975,58:251-256.

［3］TROOST J,VAN DER HEIJDEN MC,STAAL GE.Characterization of alpha-L-fucosidase from two different families with fucosidosis[J].ClinchimActa,1976,73:329-346.

［4］李興民，司伊康，楊樹(shù)德.新色原底物的合成及α-L-巖藻糖苷酶速率檢測(cè)法[J].中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1999，22：157-160.

［5］張進(jìn)平，鐘金慧.溶血對(duì)α-L-巖藻糖苷酶測(cè)定的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，9：1030-1031.