基因芯片技術(shù)分析血管緊張素原基因多態(tài)性與冠心病的關(guān)系

馬 娟，李勇國(guó)，王 瑋，田 青

（昆明市第一人民醫(yī)院 心內(nèi)科，云南 昆明 650011）

冠心病(CHD)是由遺傳和環(huán)境因素共同作用所致的復(fù)雜疾病。國(guó)外的研究大部分表明AGT基因變異與CHD具有相關(guān)性[1]，T等位基因是CHD發(fā)病的危險(xiǎn)因素，但也有一部分人認(rèn)為二者無(wú)關(guān)[2]，少數(shù)人則得出相反的結(jié)論[3]。我國(guó)對(duì)于二者關(guān)系的研究甚少，結(jié)論尚存在爭(zhēng)議。本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)AGT基因的M235T多態(tài)性，并比較其基因型及等位基因頻率，旨在探討人群AGT基因多態(tài)性和CHD的關(guān)系。

對(duì)象與方法

對(duì)象：2005～2006年期間昆明市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科收住的CHD患者100例，符合關(guān)于缺血性心臟病的命名和診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中45例確診為冠心病，急性心肌梗死(AMI)，23例診斷為冠心病，心絞痛型，12例診斷為冠心病，缺血性心肌病，成功完成基因檢測(cè)90人，均為冠狀動(dòng)脈造影證實(shí)冠狀動(dòng)脈病變患者，男62例，女28例，平均年齡(60.01±12.40)歲。同期100名對(duì)照組，成功完成基因檢測(cè)79例，男44例，女35例，平均年齡(64.27±11.28)歲，均行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)無(wú)冠脈病變。

方法：采用基因芯片檢測(cè)技術(shù)，結(jié)合PCR體外擴(kuò)增方法，檢測(cè)人類冠心病相關(guān)基因AGT基因235的多態(tài)性情況。⑴標(biāo)本采集采集被檢者靜脈血0.5ml，用一次性無(wú)菌注射針頭抽取，收集于含50μl的2%EDTA溶液的無(wú)菌1.5ml離心管中，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次使混勻。⑵存放上述血樣在2℃～8℃保存，保存期不應(yīng)超過3周；在-20℃保存期半年，-80℃可長(zhǎng)期保存，但嚴(yán)禁反復(fù)凍融。⑶采用適用0.2ml擴(kuò)增管并有熱蓋的PCR擴(kuò)增儀。⑷在芯片雜交過程中采用溫控精度為±0.5℃的恒溫設(shè)備（BaiO FLWS-526全自動(dòng)雜交儀）進(jìn)行雜交。⑸在芯片雜交信號(hào)檢測(cè)時(shí)采用BaiO BE-2.0生物芯片識(shí)讀儀。圖像Array Docctor軟件分析可自動(dòng)輸出檢測(cè)結(jié)果，最后檢測(cè)出AGTM235T基因的多態(tài)性位點(diǎn)。

質(zhì)量控制：每次檢測(cè)中都應(yīng)設(shè)置陰性、陽(yáng)性、對(duì)照品。產(chǎn)品檢測(cè)過程中，若軟件對(duì)“標(biāo)志列、陰性、陽(yáng)性對(duì)照”3者進(jìn)行判斷后，輸出其中之一為“不合格”，則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

結(jié)果判斷：由軟件自動(dòng)判斷并輸出結(jié)果，當(dāng)軟件判斷標(biāo)志列、陰性、陽(yáng)性對(duì)照均合格時(shí)，會(huì)自動(dòng)輸出檢測(cè)結(jié)果。其中，“+”表示對(duì)健康不利的基因純合子，“±”表示基因雜合子，“-”表示對(duì)健康有利的基因純合子。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：⑴首先應(yīng)用SPSS11.0軟件包作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。AGT基因型和等位基因頻率之間的比較用χ2檢驗(yàn)，同時(shí)計(jì)算優(yōu)勢(shì)比(OR)及95%可信區(qū)間（95%CI）。⑵對(duì)所選病例進(jìn)行多元Logistic回歸統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以各危險(xiǎn)因素（性別、年齡及基因型）為自變量，通過冠脈造影確診為冠心病組、正常對(duì)照組為因變量，構(gòu)建二分類Logistic回歸模型，對(duì)各危險(xiǎn)因素進(jìn)行篩選，選擇Backward LR法（后退法，似然比檢驗(yàn)）建立模型，進(jìn)入水準(zhǔn)為α＝0.05，剔除水準(zhǔn)β＝0.10（見表1）。

表1 冠心病的可能危險(xiǎn)因素與賦值

結(jié) 果

對(duì)入選患者進(jìn)行一般臨床資料分析，病例組和對(duì)照組除了在年齡（P＝0.016） 及性別構(gòu)成（P＝0.003） 的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其它指標(biāo)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見表2）。

表2 一般臨床資料在兩組中的分布

CHD組與正常對(duì)照組A GT基因M235T多態(tài)性檢測(cè)：CHD組及對(duì)照組的基因型頻率適合度檢測(cè)，顯示皆達(dá)到Hardy-werberg平衡。CHD組AGT-TT基因型頻率(45.9%)與對(duì)照組組(28.8%)基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝9.87，P＝0.007），TT型基因型與CHD呈正相關(guān)。2組T等位基因頻率分別為75%（CHD組）；61%（對(duì)照組），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2＝6.701P＝0.01 OR＝0.541，CI＝0.339-0.864），見表3。

對(duì)性別、年齡及基因型進(jìn)行多元Logistic回歸：結(jié)果，男性患者患冠心病的可能性是女性患者的3.775倍；年齡每增加10歲患冠心病的可能性就增加1.663倍。多攜帶一個(gè)T等位基因患冠心病的可能性就增加2.508倍（表4）。

表3 AGT基因M235T型基因型頻率的分布（%）

表4 方程中變量的檢驗(yàn)情況

討 論

近年來(lái)由于研究手段的進(jìn)步，人們開始對(duì)基因多態(tài)性等內(nèi)部因素給予更多地關(guān)注，其中AGT基因M235T多態(tài)性與CHD的關(guān)系倍受重視[5]。國(guó)內(nèi)外研究普遍認(rèn)為AGT基因多態(tài)性可以改變血漿AGT水平[4]，血漿AGT水平隨235T等位基因數(shù)量的增加而增加。而血漿AGT的增加又可引起血管緊張素（Ang）Ⅱ水平的過度增高，從而使血壓升高，心臟后負(fù)荷增加，導(dǎo)致心肌肥厚。AngⅡ的過度增高還可使內(nèi)皮功能失調(diào)，誘發(fā)心肌缺血及粥樣斑塊破裂。也可使低密度脂蛋白在血管壁滯留，氧化及被吞噬細(xì)胞吞噬，這些對(duì)CHD發(fā)生發(fā)展都具有促進(jìn)作用。Katsuya等[5]對(duì)422例冠心病患者和406例無(wú)冠心病的正常對(duì)照組進(jìn)行了AGT基因M235T多態(tài)性的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)AGT基因的T/T基因型頻率在冠心病組顯著高于對(duì)照組，經(jīng)Logistic回歸分析表明，AGT基因的T/T型是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Ishigami等[6]對(duì)日本人的AGT基因類型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)冠心患者中T/T基因型頻率為65.9%，顯著高于正常對(duì)照組的49.3%。陳德等[7]在上海地區(qū)研究結(jié)果提示AGT基因M235T變異可使中國(guó)人群MI的發(fā)病危險(xiǎn)性增加。但是也存在一些不同的研究結(jié)果，Arnett等的研究結(jié)果為AGT基因的M235T變異與動(dòng)脈粥樣硬化和動(dòng)脈壁增厚無(wú)相關(guān)性[8]。此外，AGT基因M235T多態(tài)性的各基因型頻率在不同種族人群中的分布有較大差異。T等位基因頻率在白人中一般為0.35～0.45，在日本人中為0.6～0.7，美洲黑人中可達(dá)0.84～0.93[4]，中國(guó)漢族人群為0.65[9]。O-livieri[10]發(fā)現(xiàn)AGT 235T等位基因頻率在亞洲與高加索人群中有相當(dāng)大的差異，分別為0.63～0.79，0.35～0.41。他從對(duì)日本和中國(guó)人群研究的結(jié)論均有爭(zhēng)議中推斷出，人群中種族的變異也可以導(dǎo)致基因型結(jié)果的不同。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，CHD人群和正常人群的AG M235T分子變異差異有顯著性。90例CHD患者和79例非冠心病患者AGT基因M235T TT型差異有顯著性，兩組T等位基因頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該人群中AGT基因M235T多態(tài)性與CHD發(fā)病有關(guān)，經(jīng)多因素Logistic回歸分析表明：T等位基因是CHD發(fā)病的危險(xiǎn)因素，多攜帶一個(gè)T等位基因患冠心病的可能性就增加2.508倍，本研究結(jié)論與中國(guó)大陸相關(guān)報(bào)道相似[7]，而與臺(tái)灣地區(qū)報(bào)道有差別[11]，支持Olivieri推斷。男性患者患冠心病的可能性是女性患者的3.775倍；年齡每增加10歲患冠心病的可能性就增加1.663倍。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來(lái)越多地致力于尋找CHD與某些基因多態(tài)性之間的關(guān)系，試圖揭示CHD的最終發(fā)病機(jī)制。不同的結(jié)果也許與病例選擇、種族、研究方法都有關(guān)系。因此，在今后的研究中應(yīng)注意候選基因的選擇要有明確的病理生理學(xué)基礎(chǔ)；候選基因多態(tài)性對(duì)其編碼的蛋白質(zhì)具有功能影響；采用更加合理的檢測(cè)方法；正確選擇研究對(duì)象，深入研究基因與基因?；蚺c環(huán)境之間的相互作用及基因型與表型的聯(lián)系等，對(duì)進(jìn)一步明確多基因相關(guān)性疾病具有重要意義?；蛐酒夹g(shù)通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原理進(jìn)行雜交，然后通過檢測(cè)探針分子雜交信號(hào)強(qiáng)度，獲得樣品中大量基因序列及表達(dá)的信息，其特點(diǎn)是高效、快速、自動(dòng)微型化、高通量、高度并行性及高度敏感性，有著廣泛的應(yīng)用前景。及早對(duì)具有冠心病易感基因的人群進(jìn)行有關(guān)健康飲食和生活習(xí)慣的宣傳和篩查，將可降低該人群冠心病的發(fā)病率和死亡率。而且因病人的遺傳背景不同，將來(lái)可能有望根據(jù)不同基因型進(jìn)行冠心病個(gè)體化預(yù)防、治療和隨訪。

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