鎖陽中兒茶素、根皮苷的提取及含量測定

李辰，陳衛(wèi)林，郭玫，邸多隆

(1. 五邑大學(xué) 分析測試中心，廣東 江門 529020；2. 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3. 甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

鎖陽中兒茶素、根皮苷的提取及含量測定

李辰1,2，陳衛(wèi)林3，郭玫3，邸多隆2

(1. 五邑大學(xué) 分析測試中心，廣東 江門 529020；2. 中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；3. 甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

建立了高效液相色譜―二極管陣列檢測器聯(lián)用測定中藥鎖陽中黃酮類化合物兒茶素、根皮苷的方法. 用C18反相色譜柱梯度洗脫法成功分離了二者；以兒茶素和根皮苷含量總和為指標(biāo)，以物料比、提取時間和提取次數(shù)為正交試驗(yàn)考察因素，優(yōu)化了鎖陽中黃酮的提取方法，得到的最佳提取條件為：28 kHz、50 ℃條件下，以藥材量7.5倍的甲醇超聲提取3次，每次30 min.該方法提取效果好，精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性較好，用于11個不同產(chǎn)地鎖陽樣品的提取和含量測定，可作為鎖陽及其制品中兒茶素和根皮苷等黃酮類化合物提取、分析及質(zhì)量控制的方法.

高效液相色譜；鎖陽；兒茶素；根皮苷

鎖陽（Cynomorium songaricum Rupr.），鎖陽科植物鎖陽的干燥肉質(zhì)莖，一種不含葉綠素的全寄生植物，主要分布于中國西北地區(qū)，如青海、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古、寧夏等地區(qū)的半荒漠或荒漠地帶. 傳統(tǒng)中藥中，鎖陽性味甘溫有力，有補(bǔ)腎陽、益精血、補(bǔ)血、潤腸通便之功效，用于腰膝痿軟、陽痿滑精、腸燥便秘[1]；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明：鎖陽提取物對人免疫缺陷病毒（HIV）[2]、抗丙型肝炎病毒（HCV）[3]、人成神經(jīng)細(xì)胞瘤[4]有抑制作用，還可用于治療婦女絕經(jīng)期癥狀[5]等. 目前，已從鎖陽中分離出有機(jī)酸、酚類、甾體、脂肪酸、黃酮、三萜、氨基酸、蛋白質(zhì)及多種維生素，多酚和黃酮等是鎖陽的主要活性成分，兒茶素是黃酮類化合物中最重要的活性成分之一，其含量的準(zhǔn)確測定非常重要. 目前以HPLC法同時測定鎖陽中兒茶素（catechin，CA）和根皮苷（phloridzin，PH）的方法鮮有報(bào)道. 本文采用HPLC-DAD（二極管陣列檢測器）法建立了同時測定鎖陽提取物中兒茶素和根皮苷的方法，并應(yīng)用于中國西部不同地區(qū)采集的11個鎖陽樣品中二者含量的分析比較.

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，包括G1312A二元泵、G1315B（DAD）、自動進(jìn)樣器和Agilent Chemstation工作站），RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠），BT 224S電子天平（德國賽多利斯儀器公司），KQ-250DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）.

1.2 材料

鎖陽藥材分別采自甘肅敦煌、民勤、安西、河西、張掖，新疆阜康、阿克蘇，青海海西州、門源，寧夏恒武，內(nèi)蒙古巴盟等11個地區(qū)，經(jīng)蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定為鎖陽科植物鎖陽的干燥肉質(zhì)莖，樣本存放于甘肅省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.

1.3 試劑

兒茶素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號877-200001），根皮苷對照品（Sigma公司，批號083K7072），純凈水，乙腈（色譜純，北京J&K Chemical Ltd.），甲醇（分析純，天津化學(xué)試劑公司），枸椽酸、N,N-二甲基甲酰胺、四氫呋喃等均為分析純.

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6mm×250mm ，5μm，美國安捷倫公司）；保護(hù)柱：Eclipse XDB-C18（4.6mm×12.5mm ，5μm，美國安捷倫公司）；流動相：乙腈（P）和水（W），梯度洗脫，12% P保持不變（0～6 min），12%～30% P（6～30 min），流速1.0 mL/min；DAD檢測波長280 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL. 色譜峰定性由對照品保留時間和紫外光譜圖確定，峰面積外標(biāo)法定量.

2.2 對照品溶液和供試品溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備

分別精密稱取兒茶素和根皮苷對照品3.10 mg和0.968 mg，以甲醇溶解并定容到5 mL的容量瓶中，二者濃度分別為0.602 mg/mL和0.194 mg/mL，作為儲備液，冰箱4 ℃保存. 用前取出放至室溫，再各稀釋5倍，濃度分別為0.120 mg/mL和0.0387 mg/mL.

2.2.2 供試品溶液制備

精密稱取晾干并粉碎的鎖陽藥材約2.001 5 g，加入15 mL甲醇，在28 kHz和50 ℃條件下超聲提取30 min，抽濾，濾渣再加入15 mL甲醇重復(fù)提取2次，抽濾，合并3次濾液，濾渣棄去. 將濾液濃縮近干，濃縮殘余物以甲醇溶解并定容至5 mL，靜置過夜. 測定前取出，放至室溫，取上清液，過0.45 μm濾膜后，直接進(jìn)HPLC分析.

圖1 兒茶素（CA）和根皮苷（PH）紫外吸收圖譜

3 結(jié)果與討論

3.1 檢測波長選擇

使用DAD在200～400 nm全波長掃描，監(jiān)測目標(biāo)化合物的最大吸收波長. 兒茶素和根皮苷的紫外吸收圖譜如圖1所示：兒茶素的特征吸收波長為210 nm和280 nm，根皮苷的特征吸收波長是225 nm和285 nm. 盡管二者在低波長處的吸收更大，但此處色譜背景的干擾也很大，故選擇280 nm對待測成分進(jìn)行同時檢測.

3.2 流動相選擇

由于兒茶素和根皮苷極性有差異，利用等度洗脫不能同時分離二者，故選用梯度洗脫. 比較后發(fā)現(xiàn)，乙腈—水梯度洗脫體系的分離效果優(yōu)于甲醇—水體系. 優(yōu)化后的梯度條件如下，流動相：乙腈（P）和水（W）；梯度：0～6 min保持12% P不變，6～30 min 12%P逐漸遞增到30%P；流速1.0 mL/min. 在此條件下，鎖陽樣品中的兒茶素、根皮苷與其他干擾成分完全分離，對照品和樣品的分離譜圖分別如圖2和圖3所示.

圖2 對照品色譜圖

圖3 樣品色譜圖（敦煌鎖陽）

3.3 樣品前處理

3.3.1 選擇提取溶劑

兒茶素和根皮苷易溶于甲醇、乙醇，比較乙醇、50%甲醇和純甲醇3種有機(jī)溶劑作提取劑對二者提取效率的影響. 經(jīng)HPLC實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：乙醇提取物成分復(fù)雜，對兒茶素和根皮苷的分離形成干擾；50%甲醇提取液提取出了較多難溶于甲醇的粘度較大的多糖成分，干擾測定；甲醇作提取劑，既能較充分地提取出所需的黃酮成分，又能減少水溶性成分的干擾，提取液濃縮定容也容易，對HPLC測定影響也小，因此，選定甲醇為提取溶劑.

3.3.2 確定提取方法

考察回流提取法、超聲提取法和索氏提取法3種提取方式，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)：超聲提取法兒茶素和根皮苷含量最高，且操作簡便省時. 以甲醇為溶劑進(jìn)行超聲提取，按表1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法考察甲醇用量（A）、提取時間（B）和提取次數(shù)（C）等影響因素，結(jié)果見表2. 以兒茶素和根皮苷提取含量總和為考察指標(biāo)，表2中極差R值大小顯示各因素作用主次為C＞B＞A；表3方差分析結(jié)果表明：A、B、C3種因素均無顯著性意義（P＞0.05），以A2B2C3為最佳提取條件，即優(yōu)化后的最佳條件為：以藥材量7.5倍（mL:g）的甲醇超聲提取3次，每次30 min.

在此基礎(chǔ)上，再考察超聲溫度（30 ℃、40 ℃）和超聲頻率（20 kHz、28 kHz）對提取的影響，結(jié)果見表4：超聲頻率對結(jié)果影響不大，但溫度影響具有顯著性，溫度越高越有利于提取. 通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：50 ℃提取效果更好，但為防止黃酮等有效成分在高溫下發(fā)生變化，影響將來的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)，最高提取溫度應(yīng)小于50 ℃為宜. 通過考察比較，最終確定的超聲提取方法為28 kHz、50 ℃條件下，以7.5倍藥材量（mL:g）的甲醇超聲提取3次，每次30 min.

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 超聲溫度和超聲頻率正交試驗(yàn)及結(jié)果

3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

3.4.1 線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢測限

用自動進(jìn)樣器分別吸取0.120 mg/mL兒茶素和0.0387 mg/mL根皮苷的對照品溶液1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、30 μL，依次進(jìn)樣，按上述色譜條件測定，以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（mAU·s）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 結(jié)果表明：兒茶素在0.120～3.612 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，根皮苷在0.0194～0.774 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

以3倍信噪比計(jì)算檢測限，得到兒茶素和根皮苷的檢測限分別為2.15 ng和0.322 ng.

3.4.2 精密度

由日內(nèi)和日間精密度評價方法的重復(fù)性，分別取0.602 mg/mL兒茶素對照品和0.194 mg/mL根皮苷對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，測得兒茶素和根皮苷峰面積的RSD分別為2.08%和1.92%；在6 d內(nèi)，每天隨機(jī)對兒茶素和根皮苷的對照品溶液進(jìn)樣1次，2個待測物峰面積6次測定結(jié)果的RSD小于3%，說明方法精密度良好.

3.4.3 穩(wěn)定性

將同一鎖陽樣品溶液放置于室溫下，連續(xù)考察5 d，每次進(jìn)樣4 μL，測得樣品中兒茶素和根皮苷含量的RSD小于3%，說明方法穩(wěn)定性較好.

3.4.4 回收率

精密稱取已知含量的鎖陽樣品5份，分別加入適量的對照品溶液，按2.2.2項(xiàng)“供試品溶液制備”方法進(jìn)行樣品提取制備，按2.1項(xiàng)“色譜條件”進(jìn)行分析，測得兒茶素和根皮苷的平均回收率分別為100.5%和99.26%，平行樣的RSD分別為1.87%和2.54%，說明方法準(zhǔn)確度較高.

3.5 樣品測定

精密稱取11個采自中國主要不同產(chǎn)地的鎖陽樣品，按2.2.2項(xiàng)“供試品溶液制備”方法和2.1項(xiàng)“色譜條件”，以HPLC測定藥材中兒茶素和根皮苷的含量，每個樣品重復(fù)測定3次. 樣品的典型圖譜見圖3，由圖可知待測組分沒有干擾，提取物不同組分間分辨率較好. 不同產(chǎn)地鎖陽中2種被測物的含量由相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到，結(jié)果列于表5.

由表5可知：1）不同產(chǎn)地供試品中兒茶素和根皮苷含量差別較大（青海海西州鎖陽兒茶素含量最高，為1.552 mg/g；內(nèi)蒙古巴盟鎖陽根皮苷含量最高，為0.046 mg/g），尤其兒茶素含量差別更大（0.145～1.552 mg/g）. 2）不同產(chǎn)地供試鎖陽樣品中2種待測物均以兒茶素含量為主，且兒茶素含量遠(yuǎn)高于根皮苷的含量；這一結(jié)果與Chu等[6]用毛細(xì)管電泳—安培檢測器測定鎖陽的結(jié)果一致（他們測得不同產(chǎn)地鎖陽中根皮苷含量為0.011～0.038 mg/g，亦與本文測定結(jié)果相近），但Chu[6]和張思巨[7]（尤其后者）所測鎖陽樣品中兒茶素含量較本文所測結(jié)果高，其測定含量為分別0.251～2.319 mg/g和0.760～20.79 mg/g，這可能與藥材生長環(huán)境、采集時間及藥材的新鮮程度等有關(guān)，如張思巨等指出鎖陽樣品中兒茶素含量與藥材新鮮程度有關(guān)，同一產(chǎn)地鎖陽鮮品中兒茶素的含量約為陳品的3倍.

表5 不同產(chǎn)地鎖陽中兒茶素和根皮苷的含量

4 結(jié)論

本文建立了HPLC梯度洗脫同時測定鎖陽中2種黃酮化合物兒茶素和根皮苷的方法，該方法操作簡便，精密度和準(zhǔn)確度較高. 利用該方法測定了采自中國西部主要產(chǎn)區(qū)的11個鎖陽樣品中兒茶素和根皮苷的含量，結(jié)果兒茶素含量均顯著高于根皮苷含量，并比較了其含量與文獻(xiàn)值的差別，指出這些差別可能是由于生長環(huán)境、藥材采集時間和新鮮程度等不同造成的. 該RP-HPLC梯度洗脫方法可被用作鎖陽及其制品的質(zhì)量控制方法.

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Extraction and Determination of (+)-Catechin and Phloridzin from Cynomorium Songaricum

LI Chen1,2, CHEN Wei-lin3, Guo Mei3, DI Duo-long2
(1. Instrumental Analysis & Research Center, Wuyi University, Jiangmen 529020, China; 2. Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources & Key Laboratory for Natural Medicine of Gansu Province, Lanzhou Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China; 3. Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

A method for the simultaneous determination of (+)-Catechin and Phloridzin in extracts of Cynomorium songaricum was developed using high performance liquid chromatographic (HPLC) coupled with diode array detector (DAD). A good separation was achieved by using a C18HPLC column with gradient elution. At the same time，the method for extracting flavonoids from C. songaricum was optimized using the total content of (+)-Catechin and Phloridzin as extraction index and with the ratio of material to liquid, extraction duration and extraction times as influential factors in the orthogonal experiment. The optimum extracting conditions were 7.5 times quantity of methanol to herbal material at 28 kHz and 50 ℃, extraction for three times for 30 min each time. The proposed method was used to extract and determine the two flavonoids in C. songaricum collected from different producing area. The result showed that the method was good in aspects of extraction, precision, accuracy and stability. It can provide a reference to the extraction, analysis and quality control offlavonoids in C. songaricum and its products.

high performance liquid chromatography(HPLC); Cynomorium songaricum; (+)-Catechin; Phloridzin

O657.7；R914.4

A

1006-7302（2011）01-0023-06

2010-06-30

甘肅省中醫(yī)藥科研課題資助項(xiàng)目（GZK220052015）

李辰（1976—），男，甘肅蘭州人，講師，博士，主要從事天然產(chǎn)物分離分析及質(zhì)控方法研究.