TRAIL受體 DR4、DR5、DcR1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及意義

王雪平 羅 玉賢 馬 亮亮 顧 福杭 赫 建平 陳娟

結(jié)腸癌是發(fā)生于結(jié)腸部位的常見消化道惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤第三位，其發(fā)病率逐年上升，人們一直都在積極尋求攻克結(jié)腸癌的方法，但到目前為止仍然沒有十分有效的治療手段。現(xiàn)有的傳統(tǒng)治療方法如化學(xué)治療、放射治療、免疫治療等雖然能殺滅腫瘤細(xì)胞，但卻無法避免殺滅人體的正常組織細(xì)胞，有著嚴(yán)重的不良反應(yīng)。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)，是1995年Wiley等［1］發(fā)現(xiàn) TNF超家族的新成員，被稱為繼FasL、腫瘤壞死因子(TNF)之后第三個(gè)凋亡因子，它具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用。TRAIL通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮其選擇性的細(xì)胞毒性作用。本文對(duì)TRAIL受體DR4、DR5、DcR1在結(jié)腸癌中的表達(dá)進(jìn)行研究，探討其對(duì)結(jié)腸癌治療的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 35例結(jié)腸癌組織取自石家莊市第一醫(yī)院2007至2010年經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)腸癌組織標(biāo)本，同時(shí)以14例良性結(jié)腸組織(外傷或良性造瘺等)為正常對(duì)照，全部標(biāo)本均經(jīng)病理診斷證實(shí)。

1.2 方法 采用免疫組化SP法染色，步驟嚴(yán)格按試劑盒說明操作。一抗工作濃度 DR4、DR5為1∶50，DcR1為1 100。以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。免抗人DR4、DR5、DcR1多克隆抗體購于美國NeoMarkers公司;鼠及兔SPN免疫組化試劑盒、DAB試劑盒購于美國ZYMED公司。

1.3 結(jié)果判定 采用半定量積分法，根據(jù)免疫組化染色反應(yīng)的深度及陽性細(xì)胞的數(shù)量分別記分為0～3分，其中染色深度以多數(shù)細(xì)胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn)。淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，不著色為0分。陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為0分，11%～45%為1分，46% ～70%為2分，＞70%為3分，并根據(jù)這兩項(xiàng)指標(biāo)的積分?jǐn)?shù)分為4級(jí)，即陰性(－)為0分，弱陽性(+)為2分，陽性(++)為3～4分，強(qiáng)陽性(+++)為5～6分。應(yīng)用Olyumpus BX51型光學(xué)顯微鏡觀察并攝片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

TRAIL受體DR4、DR5、DcR1免疫陽性產(chǎn)物均為棕黃色顆粒，定位于胞漿或胞膜。結(jié)腸癌組織中DR5、DR4、DcR1的陽性表達(dá)率，均明顯高于正常結(jié)腸黏膜組織(P＜0.05)。DR5的陽性表達(dá)率明顯高于DR4(P＜0.05)。正常結(jié)腸黏膜組織中DcR1的陽性表達(dá)率明顯高于結(jié)腸癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表 1。

表1 DR4、DR5和DcR1在結(jié)腸癌及正常結(jié)腸組織中的表達(dá) 例(%)

3 討論

TRAIL是1995年Wiley等［1］發(fā)現(xiàn)TNF超家族的新成員，為Ⅱ型膜蛋白，與其受體(TRAIL-R)結(jié)合后可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，能特異性地誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)大多數(shù)正常細(xì)胞幾乎沒有毒性，使其成為目前腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前已知的 TRAIL受體共有5種:DR4、DR5、DcR1、DcR2和OPG，其中，DR4、DR5含有胞漿內(nèi)“死亡域”，與 TRAIL結(jié)合能夠傳遞凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，故稱為“死亡受體”(death receptor，DR)。DcR(decoy receptor)即誘騙受體，包括 DcR1和DcR2，主要表達(dá)于正常細(xì)胞，它們不含完整的死亡域(death domain，DD)，故不引起正常細(xì)胞凋亡［2］。OPG(osteoprotegerin):是TRAIL的一種可溶性受體，主要作用是調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的代謝。TRAIL通過與 DR4、DR5結(jié)合，死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)可被誘導(dǎo)合成，通過觸發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致程序性細(xì)胞凋亡［3］。無論凋亡信號(hào)在細(xì)胞內(nèi)如何傳遞，TRAIL要發(fā)揮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用必須首先與其受體結(jié)合。因此，細(xì)胞表面TRAIL受體表達(dá)水平及功能對(duì)TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡至關(guān)重要。對(duì)于TRAIL-R在結(jié)腸癌中表達(dá)情況的研究，可為應(yīng)用TRAIL治療結(jié)腸癌提供重要的理論基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果顯示，DR5在結(jié)腸癌中的陽性表達(dá)率為27/35(77.14%)，DR4的陽性表達(dá)率為19/35，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(54.28%)，均明顯高于正常結(jié)腸黏膜組織 4/14(28.57%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。DR4、DR5是TRAIL的功能受體，它可以介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)腸癌中DR4、DR5的高表達(dá)為TRAIL用于結(jié)腸癌的臨床治療提供了理論依據(jù)。

Kim等［4］的研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性主要與DR4的表達(dá)有關(guān)，而與DR5的表達(dá)無關(guān);Dominic Stadel研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌中TRAIL誘導(dǎo)的凋亡優(yōu)先通過TRAIL-R1(DR4)，XIAP抑制劑可增強(qiáng)其能力［5］。而另外有些學(xué)者則得出相反結(jié)論，認(rèn)為主要與 DR5的表達(dá)有關(guān)［6］。Wang等［7］應(yīng)用 RNA 干擾技術(shù)獲得了DR5表達(dá)缺失的結(jié)腸癌細(xì)胞系，將其接種裸鼠后發(fā)現(xiàn)移植瘤對(duì)化療藥物5-FU產(chǎn)生了抗性，提示DR5可能在腫瘤發(fā)生和化療耐藥方面起著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，DR5在結(jié)腸癌中的表達(dá)27/35(77.14%)要高于DR4在結(jié)腸癌中的表達(dá)19/35(54.28%)，據(jù)此推測可能DR5在結(jié)腸癌的發(fā)病中所起的作用更積極一些。Truneh等［8］研究表明，TRAIL與受體的結(jié)合力是受溫度調(diào)控的。在4℃時(shí)，TRAIL與其所有受體的結(jié)合力相似;而在37℃時(shí)TRAIL與DR5有最高的親和力。因此，在機(jī)體及細(xì)胞的最適生存溫度(37℃)時(shí)，DR5相對(duì)于其它受體來講，將以更強(qiáng)的親和力與TRAIL結(jié)合并介導(dǎo)凋亡反應(yīng)。由此提示，DR5可能在TRAIL誘導(dǎo)的凋亡通路中發(fā)揮更重要的作用，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

此外，本研究結(jié)果還顯示，DcR1在正常結(jié)腸黏膜組織中陽性表達(dá)率為100%，主要表達(dá)于正常結(jié)腸粘膜組織，在正常結(jié)腸黏膜組織高表達(dá)的DcR1可與死亡受體DR5競爭結(jié)合TRAIL，從而保護(hù)其免受TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。而在結(jié)腸癌中DcR1也有低表達(dá)(37.14%)，推測結(jié)腸癌中DcR1的表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡耐受有關(guān)，它是否競爭與TRAIL結(jié)合，使癌細(xì)胞逃脫凋亡誘導(dǎo)，變得對(duì)TRAIL不敏感，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

1 Wiley SR，Schooley K，Smolak PJ，et al.Identification and characterization of a newmemberof theTNF family that induces apoptosis.Immunity，1995，3:673-682.

2 Kim K，F(xiàn)isher MJ，Xu SQ，et al.Molecular determinants of response to TRAIL in killing ofnormal and cancer cells.Clin Cancer Res，2000，6:335-346.

3 Pennarun B，Meijer A，de Vries EG，et al.Playing the DISC:Turning on TRAIL death receptor-mediated apoptosis in cancer.Biochim Biophy Acta，2010，1805:123-140.

4 Kim Y，Seol DW.TRAIL，a mighty apoptosis inducer.Mol Cells，2003，15:283-293.

5 Stadel D，Mohr A，Ref C，et al.TRAIL-Induced Apoptosis Is Preferentially Mediated via TRAIL Receptor 1 in Pancreatic Carcinoma Cells and Profoundly Enhanced by XIAP Inhibitors.Clin Cancer Res，2010，16:5734-5749.

6 Takeda K，Yamaguchi N，Akiba H，et al.Induction of tumor-specific T cell immunity by anti-DR5 antibody therapy.J Exp Med，2004，199:437-448.

7 Wang S，EIDeiry WS.Inducible silencing ofKILLER/DR5 in vi-vo promotes bioluminescent colon tumor xenograft growth and con-fers resistance to chemotherapeutic agent 5-fluorouracil.Cancer Res，2004，64:6666-6672.

8 Truneh A，Sharna S，Silverman C，et al.Temperature-sensitive differ-ential affinity of TRAIL for its receptors.DR5 is the highest affinity receptor.J Biol Chem，2000，275:23319-23325.