Mito-KATP在七氟醚延遲預(yù)處理減輕大鼠心肌缺血再灌注氧化損傷中的作用*

肖艷英 常業(yè)恬 冉 珂 李雙鳳

研究認(rèn)為，過(guò)多氧自由基生成和氧化還原系統(tǒng)平衡被破壞是心肌缺血再灌注損傷的重要機(jī)制，吸入麻醉藥預(yù)處理的早期心肌保護(hù)作用與其增加抗氧化酶的活性有關(guān)[1]。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶Mu（gluta?thione S-Transferase Mu，GSTM)是抗氧化系統(tǒng)的重要成員。近年來(lái)的研究證實(shí)GSTM能夠抑制心肌蘭尼堿受體鈣離子釋放通道（ryanodine receptor Ca2+release channel，RyR），減少鈣離子釋放，可能是減少心肌缺血再灌注后鈣超載的因素[2-3]。線(xiàn)粒體三磷酸腺苷敏感性鉀通道（mito-KATP）在吸入麻醉藥預(yù)處理產(chǎn)生的心肌保護(hù)中發(fā)揮重要作用[4]。本研究旨在觀(guān)察七氟醚延遲預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注的抗氧化作用以及抗氧化酶GSTM的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)成年雄性SD大鼠60只，9～10周齡，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按照隨機(jī)數(shù)字法分為5組，每組12只：假手術(shù)組（Sham組）開(kāi)胸但不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈；缺血再灌注組（IR組）阻斷左冠狀動(dòng)脈前降支30 min，再灌注120 min；七氟醚預(yù)處理組（SPC組）心肌缺血前24 h吸入2.5%七氟醚1 h；七氟醚預(yù)處理+mito-KATP特異性阻斷劑5-羥基癸酸（5-HD）組（SPC+5-HD組），七氟醚預(yù)處理前10 min經(jīng)尾靜脈給予mito-KATP特異性阻斷劑5-HD（5 mg/kg）；5-HD組，心肌缺血前24 h給予5-HD。

1.2 主要試劑與儀器 大鼠心肌肌鈣蛋白I（cTnI）檢測(cè)試劑盒（上海西唐生物科技有限公司），GSTM多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，5-羥基癸酸(美國(guó)Sigma 公司)，七氟醚(美國(guó)Abbott公司)，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所），七氟醚揮發(fā)罐和氣體監(jiān)測(cè)儀（美國(guó)Datex-Ohmeda公司），Western blot電泳和電轉(zhuǎn)儀設(shè)備(美國(guó)Bio Rad公司)。

1.3 造模 操作參照參考文獻(xiàn)[1]，SPC組和SPC+5-HD組大鼠放置于有機(jī)玻璃箱中保留自主呼吸，吸入2.5%七氟醚1 h，出氣口連接麻醉氣體監(jiān)測(cè)儀監(jiān)測(cè)出口氣體七氟醚、O2及CO2的濃度。Sham組，IR組和5-HD組給予純氧吸入。采用參考文獻(xiàn)[5]的方法，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支30 min后，再灌注120 min建立大鼠在體心肌缺血再灌注模型。于胸骨左緣3～4肋間開(kāi)胸，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，Ⅱ?qū)?lián)心電圖出現(xiàn)ST段抬高或者心尖發(fā)紺被認(rèn)為結(jié)扎成功。30 min后松開(kāi)結(jié)扎線(xiàn)再灌注120 min，以出現(xiàn)ST段回落1/2以上或者左室反應(yīng)性充血為再灌注成功標(biāo)志。MD3000型生物信號(hào)采集系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測(cè)心率（HR）、平均動(dòng)脈壓（MAP）和Ⅱ?qū)?lián)心電圖。

1.4 心肌梗死面積測(cè)定 每組6只大鼠用于確定梗死面積，灌注末再次結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈，經(jīng)尾靜脈給予1%伊文思藍(lán)2 mL確定心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)域。修剪留取左室沿心臟橫軸切成1.5 mm厚左右切片，氯化三苯四氮唑（TTC）染色后拍照，采用Image pro plus 6.0專(zhuān)業(yè)分析軟件分析測(cè)量左室面積（LV），危險(xiǎn)區(qū)域面積（AAR）和梗死面積（IS），計(jì)算危險(xiǎn)區(qū)域（AAR/LV）和梗死區(qū)域百分比（IS/AAR）。

1.5 血清cTnI檢測(cè) 再灌注結(jié)束后留取頸動(dòng)脈血1 mL，4℃相對(duì)離心力（RCF）1 800×g（3 000 r/min）離心15 min后取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒檢測(cè)血清cTnI水平。

1.6 心肌MDA、Ca2+含量和SOD、GST活性檢測(cè) 硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA，甲基麝香草酚藍(lán)比色法測(cè)定心肌內(nèi)鈣離子含量，黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性。按照文獻(xiàn)[6]的方法,根據(jù)GST對(duì)經(jīng)典底物1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）的結(jié)合活性，以每分鐘每毫克心肌消耗CDNB的摩爾數(shù)來(lái)表示心肌中GST的活性（nmolCDNB·mg-·1min-1）。按照MDA、SOD、GST試劑盒說(shuō)明書(shū)配制試劑，測(cè)定各管光密度，Bio-Rad法檢測(cè)蛋白含量。根據(jù)公式計(jì)算心肌組織中MDA、SOD、GST含量。

1.7 Western blot檢測(cè)心肌GSTM表達(dá) 再灌注結(jié)束剪取左室提取心肌蛋白，于12%SDS-PAGE凝膠上電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉2 h后，按照1∶500稀釋比例加入一抗GSTM抗體，放置過(guò)夜，按照1∶1 000稀釋比例加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，掃描后應(yīng)用Gel pro4.0凝膠光密度分析軟件進(jìn)行分析。以Sham組為參照（100%），各組心肌GSTM含量以與Sham組比較相對(duì)表達(dá)量表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組AAR/LV、IS/AAR及cTnI比較 IR組IS/AAR和血清cTnI水平較Sham組明顯增加；SPC組IS/AAR和血清cTnI水平較IR組減少；SPC+5-HD組IS/AAR和血清cTnI水平較SPC組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），5-HD組各項(xiàng)指標(biāo)與IR組及SPC+5-HD組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠心肌MDA、Ca2+含量、SOD、GST活性及心肌GSTM表達(dá)比較 IR組心肌MDA含量和Ca2+濃度較Sham組增加，而SOD和GST活性降低（P<0.01）；SPC組較IR組減少了心肌MDA含量和Ca2+聚集，增加了SOD和GST活性（P<0.01）；SPC+5-HD組較SPC組心肌MDA含量和Ca2+濃度增加，而SOD和GST活性降低（P<0.01）。SPC組較IR組心肌GSTM表達(dá)增加，而SPC+5-HD組較SPC組心肌GSTM降低（P<0.01），5-HD組各項(xiàng)指標(biāo)與IR組及SPC+5-HD組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

3 討論

心肌IR臨床常見(jiàn)，氧化應(yīng)激和鈣超載被認(rèn)為是其重要機(jī)制。再灌注后氧自由基大量生成,與細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸結(jié)合生成脂質(zhì)過(guò)氧化物,引起膜通透性改變和膜蛋白的脂質(zhì)微環(huán)境改變，加重細(xì)胞內(nèi)鈣超載[1]。機(jī)體內(nèi)有SOD和谷胱甘肽代謝酶系統(tǒng)2個(gè)重要的抗氧化系統(tǒng)，SOD能夠清除多余的超氧陰離子，而后者是一系列氧自由基生成的啟動(dòng)環(huán)節(jié)；GST是谷胱甘肽代謝酶系統(tǒng)的重要成員，能催化脂質(zhì)過(guò)氧化物與谷胱甘肽結(jié)合而消除脂質(zhì)過(guò)氧化物[6]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物，可作為判斷細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷程度的指標(biāo)之一[6]。因此，本研究中選擇Ca2和MDA作為判斷氧化損傷指標(biāo)，SOD和GST活性作為抗氧化能力指標(biāo)。有研究顯示七氟醚早期相預(yù)處理能夠增加SOD活性，減少M(fèi)DA產(chǎn)生，減少心肌梗死面積和改善心功能[1]。本研究中各缺血組心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)域（AAR/LV）在一個(gè)相似的范圍，表明模型建立成功。七氟醚延遲預(yù)處理也能減少缺血再灌注后梗死面積、血清cTnI釋放，增加了SOD和GST的活性，表明七氟醚延遲預(yù)處理也能夠減輕氧化損傷。

表1 各組AAR/LV、IS/AAR及血清cTnI比較（n=6±s）

表1 各組AAR/LV、IS/AAR及血清cTnI比較（n=6±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別Sham組（1）IR組（2）SPC組（3）SPC+5-HD組（4）5-HD組（5）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）（2）：（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）AAR/LV（%）0 41±7 42±8 39±6 37±5 51.2**16.33**16.71**15.72**14.99**0.38 0.61 1.34 0.99 1.72 0.73 IS/AAR（%）0 40±8 20±4 42±2 37±3 89.9**21.43**10.61**22.27**19.62**10.81**0.85 1.81 11.66**9.01**2.65 cTnI（μg/L）4.9±0.6 50.2±7.5 24.9±3.1 44.7±7.6 53.2±10.1 52.4**16.12**7.00**14.31**16.97**9.11**1.81 0.85 7.31**9.97**2.66

表2 各組大鼠心肌MDA、Ca2+含量、SOD、GST活性和GSTM表達(dá)比較 （n=6±s）

表2 各組大鼠心肌MDA、Ca2+含量、SOD、GST活性和GSTM表達(dá)比較 （n=6±s）

*P<0.05，**P<0.01

Sham組（1）IR組（2）SPC組（3）SPC+5-HD（4）5-HD組（5）F q（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）：（3）（2）∶（4）（2）∶（5）（3）∶（4）（3）∶（5）（4）∶（5）Ca2+（nmol/g）5.4±0.7 8.9±0.7 6.6±0.4 8.6±0.6 8.3±0.5 40.2**14.64**4.96**13.48**12.37**9.68**1.16 2.26 8.52**7.41**1.10 MDA（nmol/mg）3.2±0.6 18.2±3.4 11.9±2.4 20.7±3.8 19.4±1.4 46.2**14.04**8.18**16.41**15.19**5.86**2.37 1.15 8.24**7.01**1.23 SOD（U/mg）185.7±23.6 101.0±19.7 140.9±16.5 102.9±12.5 97.7±14.6 27.4**11.77**6.24**11.29**12.24**5.53**0.47 0.48 5.05**6.00**0.95 GST（nmol CDNB·mg-1·min-1）868.7±58.4 539.1±59.0 659.2±31.3 527.2±89.0 530.3±62.1 33.0**12.88**8.19**13.34**13.23**4.69**0.47 0.35 5.16**5.04**0.12 GSTM（%）100 48.1±8.7 83.3±10.5 44.3±14.7 47.4±7.0 42.9**13.39**4.31**14.35**13.55**9.08**0.96 0.17 10.03**9.24**0.79組別

研究顯示延遲預(yù)處理的心肌保護(hù)作用與基因激活和保護(hù)性蛋白質(zhì)合成有關(guān)，抗氧化酶被認(rèn)為是潛在的心肌保護(hù)性蛋白[4,6]。有研究認(rèn)為SOD在多種形式延遲相預(yù)處理（包括熱適應(yīng)，低溫，缺血預(yù)適應(yīng)等）后表達(dá)增加[4]。Dikmen等[6]發(fā)現(xiàn)在七氟醚預(yù)處理后3 d不僅能增加SOD表達(dá)，也能增加GST表達(dá)，認(rèn)為GST可能也是一種保護(hù)蛋白。GST具有多種同工酶，不同的同工酶在組織內(nèi)表達(dá)有差異，其中Mu類(lèi)GST（GSTM）在心肌大量表達(dá)[2]。本研究結(jié)果表明七氟醚延遲預(yù)處理能增加GSTM表達(dá)，考慮可能七氟醚心肌保護(hù)作用與GSTM表達(dá)增加有關(guān)。近年來(lái)研究認(rèn)為GSTM不僅僅是谷胱甘肽代謝酶系統(tǒng)重要成分，而且可以與蘭尼堿受體鈣離子釋放通道（RyR）結(jié)合，其中亞型GSTM2-2能特異性抑制心臟的RyR2的活性，抑制心肌肌漿網(wǎng)的鈣離子釋放[3]。缺血再灌注中鈣超載和過(guò)量的氧自由基互相影響和促進(jìn)，氧自由基使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，對(duì)Ca2+通透性增加,加重細(xì)胞內(nèi)鈣超載；細(xì)胞內(nèi)鈣超載激活鈣敏感蛋白水解酶以及鈣依賴(lài)性磷脂酶，是形成大量活性氧的來(lái)源[5]。GSTM的作用可能與其抗氧化作用以及抑制鈣離子釋放有關(guān)。

mito-KATP是線(xiàn)粒體上一類(lèi)特殊的內(nèi)向整流鉀離子通道。大量的研究認(rèn)為mito-KATP在吸入麻醉藥預(yù)處理的心肌保護(hù)機(jī)制中起重要作用[4]。有學(xué)者認(rèn)為吸入麻醉藥預(yù)處理引起mito-KATP開(kāi)放的機(jī)制是患者吸入麻醉藥后，激活細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的蛋白激酶信號(hào)通路，通過(guò)PKC-ε轉(zhuǎn)位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜而使mi?to-KATP開(kāi)放[4]。但是也有學(xué)者認(rèn)為吸入麻醉藥可以自由通過(guò)細(xì)胞膜和線(xiàn)粒體膜，直接作用于線(xiàn)粒體膜上的mito-KATP，促使其開(kāi)放[7]。Mito-KATP開(kāi)放后引起線(xiàn)粒體膜電位短暫的去極化和線(xiàn)粒體呼吸脫偶聯(lián)，產(chǎn)生少量的活性氧（ROS）；而ROS的產(chǎn)生也可以促使mito-KATP開(kāi)放，形成正反饋，促使預(yù)處理信號(hào)的不斷傳遞和放大[7]。ROS的產(chǎn)生亦可以作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及心肌保護(hù)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄。本研究中在七氟醚預(yù)處理前給予5-HD取消七氟醚心肌保護(hù)作用，可能是5-HD阻斷了預(yù)處理信號(hào)通過(guò)mito-KATP向下游傳遞，提示mito-KATP在吸入麻醉藥延遲預(yù)處理心肌保護(hù)作用通路中重要作用。

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