丹曲林對缺血再灌注大鼠心肌糖代謝酶活性的影響*

王麗艷 趙曉麗 郭彥青 曹 穎 于公元 康英姿

心肌缺血再灌注損傷是臨床上缺血性心臟病、休克、體外循環(huán)心血管手術等各種疾病和治療過程中常見的病理損傷。鈣超載是心肌缺血再灌注損傷的特征之一，是心肌缺血再灌注發(fā)展為不可逆階段的共同途徑[1]。丹曲林（dantrolene）在臨床上主要適用于治療惡性高熱病，是細胞內質網上鈣通道受體的拮抗劑，可降低細胞質內過高的游離鈣離子濃度，減輕鈣超載。有研究表明，丹曲林可保護大鼠缺血再灌注心臟的功能[2]。本研究從有氧氧化和糖酵解的關鍵酶出發(fā)，進一步探討丹曲林對缺血再灌注心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及分組 16只2級健康雄性Wistar大鼠購自北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，體質量300～350 g。隨機分為對照組與丹曲林預處理組（丹曲林組）,每組8只。

1.1.2 主要試劑與實驗儀器 所需試劑為腺苷三磷酸（ATP）、腺苷二磷酸（ADP）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）、6磷酸果糖、醛縮酶、磷酸丙糖異構酶、α-磷酸甘油脫氫酶、異檸檬酸和磷酸烯醇式丙酮酸等購自Sigma公司，UV-2450紫外/可見分光光度計（日本島津），CF-2000D超純水器（北京市長風儀器儀表公司），Langendorff灌流裝置。Krebs液（單位：mmol/L）：NaCl 118.0，KCl 4.7，NaHCO325.0，CaCl22.5，MgSO41.2，KH2PO41.2，丙酮酸鈉2.0，葡萄糖11.0。溶液充以95%O2和5%CO2混合氣體。

1.2 方法

1.2.1 離體心臟灌流模型的建立 大鼠乙醚吸入麻醉，在其股動脈注入3 U/g肝素抗凝，迅速沿著劍突下肋緣剪開腹壁，沿兩側腋前線剪開胸壁，于心臟根部保留主動脈3～4 mm剪下心臟，立即放入4℃Krebs液中，主動脈插管，左心房套管，固定于Langedorff灌流柱口，灌流壓恒定于10 kPa,觀察心臟自主搏動情況。整個灌流系統(tǒng)用恒溫水浴循環(huán)器維持在37℃。在灌流5 min和30 min時記錄心率（HR）、主動脈流量（AF）、冠狀動脈流量（CF）和心輸出量（CO）。在心臟灌流平衡30 min后，對照組夾閉主動脈和心房套管，全心梗死30 min，再灌注1 h；丹曲林預處理組在平衡10 min末，Krebs液中加入 5 μmol/L 丹曲林 500 μL 灌注 20 min，然后梗死 30 min，再灌注1 h。

1.2.2 標本來源及操作過程 灌注末從灌流裝置摘取心臟，稱質量，剪碎，按1∶7加入蔗糖咪唑（300 mmol/L蔗糖，10 mmol/L咪唑，pH 7.4，4℃），在冰上充分勻漿，勻漿液在4℃條件下差速離心，3 000 r/min離心10 min后棄沉淀留上清，上清液10 000 r/min離心20 min，2次，沉淀即為線粒體。其中上清液超速離心24 000 r/min，30 min棄沉淀留取上清液，上清及線粒體-70℃冷凍備用。應用Folin酚法測定各組上清和線粒體液蛋白含量。

1.2.3 酶活性測定方法 采用分光光度計法測定異檸檬酸脫氫酶（IDH）、6-磷酸果糖激酶-1（PFK）、己糖激酶（HK）和丙酮酸激酶（PK）的活性。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0的統(tǒng)計軟件，計量資料以均數±標準差±s）表示,兩組間均數比較用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 丹曲林對心臟血流動力學基本指標的影響 灌流30 min后，丹曲林組CF較對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），HR、AF和CO差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

2.2 丹曲林對糖代謝酶活性的影響 與對照組相比，丹曲林組PFK、PK、HK和IDH活性均有降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05或P<0.01），見表2。

3 討論

本實驗中加入5 μmol/L的丹曲林，血流動力學指標除了冠脈流量增加外，其他指標基本無變化。這與加入丹曲林的濃度有關。高濃度（16～45 μmol/L）的丹曲林能增加冠脈流量，降低主動脈流量和心輸出量，而低濃度（≤4 μmol/L）的丹曲林僅會引起冠脈流量的增加[2]。

表1 對照組與丹曲林組心臟血流動力學變化（n=8 ±s）

表1 對照組與丹曲林組心臟血流動力學變化（n=8 ±s）

**P<0.01

對照組丹曲林組t灌流5 min 251.8±7.8 254.0±5.8 0.550灌流30 min 252.6±8.8 260.0±10.3 1.270灌流5 min 54.7±1.9 55.3±2.7 0.490灌流30 min 53.8±1.5 54.3±1.4 0.610灌流5 min 20.5±1.0 19.5±1.9 1.140灌流30 min 19.3±1.2 26.2±1.5 8.780**灌流30 min 75.2±1.3 76.2±1.1 1.640灌流5 min 75.4±0.9 75.9±1.4 0.760對照組丹曲林組t HR（次/min） AF（mL/min）CF（mL/min） CO（mL/min）組別組別

表2 對照組與丹曲林組IDH、PFK、PK、HK活性（n=8，U/mg±s）

表2 對照組與丹曲林組IDH、PFK、PK、HK活性（n=8，U/mg±s）

*P<0.05，**P<0.01

組別對照組丹曲林組t PFK 0.534±0.109 0.341±0.079 4.052**PK 6.027±1.022 4.853±0.613 3.081**HK 0.402±0.088 0.268±0.071 3.358**IDH 3.744±0.464 3.228±0.349 2.510*

心肌能量代謝主要以脂肪酸氧化為主，在一些病理狀態(tài)下，如心肌肥大和缺血再灌注時，代謝方式轉為葡萄糖代謝為主[3]。本實驗從糖代謝的酶活性的變化，進一步探討丹曲林對缺血再灌注心肌保護作用的機制。心肌缺血伴隨著缺氧，使心臟依賴無氧糖酵解產生ATP供應機體的代謝，糖酵解產生能量的同時也生成大量的H+。細胞中大量的H+通過Na+/H+交換體，增加細胞內Na+的積累，Na+的積累又通過Na+/Ca2+交換體使大量Ca2+內流入細胞[4]，形成Ca2+超載。本實驗中丹曲林預處理后糖酵解的HK、PFK和PK的活性均低于對照組。即與缺血再灌注組相比，丹曲林預處理后糖酵解增強的程度減弱，隨之產生的H+相對較少。減少的H+減弱了Ca2+超載對心肌缺血再灌注的損傷作用[5]。這也說明丹曲林對缺血再灌注的心肌有保護作用。

IDH是有氧氧化的關鍵酶之一，它的活性反映糖有氧代謝的能力。有實驗結果表明心肌梗死再灌注后缺血區(qū)與非缺血區(qū)比較，IDH活性增加[6]。再灌注時IDH活性的增加促進了再灌注時能量的恢復。本研究結果表明，與對照組相比，丹曲林組IDH活性較低。可能是由于丹曲林改善了缺血再灌注心肌的能量代謝，保存細胞內的高能磷酸化合物。丹曲林相對降低了缺血再灌注心肌IDH的活性，其機制可能是由于丹曲林抑制鈣超載，降低了鈣離子對IDH的作用。由于缺血再灌注心肌胞質Ca2+超載，而胞質Ca2+超載會引起線粒體基質內Ca2+濃度的增加[7]，線粒體內增加的Ca2+直接與IDH和α-酮戊二酸脫氫酶結合，降低其對底物的米氏常數（Km）而使酶激活[8]。丹曲林作為細胞內質網上鈣通道（Ryano?dine受體）的拮抗劑，減少Ca2+從內質網釋放入胞漿，減輕胞質Ca2+超載，線粒體中Ca2+濃度也相對較低，減弱了對激活酶的作用，因此丹曲林預處理組的IDH活性低于對照組。

綜上所述，丹曲林降低了缺血再灌注大鼠心肌糖代謝酶的活性，從而部分恢復了因缺血再灌注損傷引起的代謝方式的轉變，這為丹曲林治療心肌梗死再灌注的患者提供了一定的理論依據，但丹曲林能否使代謝方式恢復至正常水平，尚需進一步研究。

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