高壓氧治療對正常及SIRS大鼠脾細胞凋亡的影響

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科(110001) 葛百平 趙寶寶 馮 芳 王 鋼

作者:葛百平，中國醫(yī)科大學(xué)急診科研究生在讀，現(xiàn)工作單位沈陽急救中心。

導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)和多器官功能衰竭(MODS)發(fā)生的主要誘因幾乎能誘發(fā)所有類型細胞的凋亡[1-2]，免疫炎癥細胞凋亡紊亂及靶器官細胞大量凋亡的結(jié)果也可能是SIRS/MODS發(fā)生發(fā)展的因素之一[3-7]。SIRS的發(fā)生發(fā)展過程中有多種因素可以啟動細胞凋亡。目前的研究認(rèn)為，免疫細胞的大量凋亡是SIRS狀態(tài)下免疫功能低下的重要原因。高壓氧(HBO)治療應(yīng)用于SIRS狀態(tài)下的研究目前主要集中于炎癥、缺血/再灌注損傷等方面。而HBO對SIRS狀態(tài)免疫功能影響方面的研究比較少見。HBO治療指的是在2～3ATA(1ATA=101.325kPa)下給 100%的 O2，使動脈血氧分壓(PaO2)達2000mmHg(1mmHg=0.133kPa)，組織血氧分壓達400mmHg。HBO是一氧化碳中毒、減壓病和動脈氣體栓塞首選治療方法，在放射性骨病、梭狀芽孢桿菌性肌壞死、難治性骨髓炎等疾病和皮膚移植中的療效也被充分肯定[8]，目前關(guān)于其在嚴(yán)重創(chuàng)傷或感染導(dǎo)致的SIRS狀態(tài)下的應(yīng)用也逐步探索。脾臟作為機體最大的免疫器官，占全身淋巴組織總量的25%，含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心，在對臨床患者的研究中表明，SIRS患者存在明顯的脾臟淋巴細胞凋亡的增加[9]。本實驗就正常及SIRS狀態(tài)下的大鼠脾細胞凋亡為對象，研究HBO治療對于正常及SIRS狀態(tài)下機體的免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康雄性SD大鼠50只，購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，體重約140～180g，隨機分為5組，每組10只。A組:腹腔注射等量生理鹽水;B組:腹腔注射等量生理鹽水，做3次HBO;C組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg);D組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg)，做1次HBO;E組:腹腔注射酵母多糖-石蠟懸液(500mg/kg)，做3次HBO。

1.2 主要試劑、儀器 酵母多糖-A(Sigma公司);AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑/試劑盒(Biovison公司);流式細胞儀，DWC400A/02-1型動物HBO艙。

1.3 大鼠SIRS模型建立 將酵母多糖粉劑和無菌液體石蠟混合，高頻振蕩15分鐘，100℃水浴80分鐘滅菌，制成濃度為100mg/mL的酵母多糖A-石蠟混懸液，存放于4℃?zhèn)溆?。臨用前40℃ 水浴復(fù)溫，高頻振蕩15分鐘后供注射。大鼠實驗前18小時開始禁食，不禁水。C、D、E組以500mg/kg體重予大鼠腹腔注射酵母多糖A-石蠟懸液，A、B組注射等量生理鹽水。

1.4 HBO治療方案 1次HBO的時間為腹腔注射后4小時，3次HBO的時間分別為腹腔注射后4小時、10小時、18小時。每次 HBO都遵循以下方案:100%純氧洗艙5分鐘，以清除艙內(nèi)原有空氣。勻速加壓至2ATA(15分鐘)，用已校對的測氧儀測艙內(nèi)氧濃度達90%以上，期間以4L/min的速度持續(xù)通O2避免CO2蓄積，并將壓力維持在2ATA。1小時后以同樣速度勻速減至常壓，出艙。

1.5 標(biāo)本采集及檢測 腹腔注射24小時后，標(biāo)記大鼠順序殺鼠取脾、標(biāo)號，脾臟剪至糊狀，100目篩濾過(加PBS)，離心1000rpm10分鐘，棄上清，低滲休克法溶解紅細胞，RPMI1640調(diào)整細胞濃度1×106/mL，取上述液體0.1mL進行如下步驟:4℃離心10分鐘，棄上清，加入冷PBS1mL，輕輕震蕩，于4℃下1000rpm離心10分鐘，棄上清，重復(fù)2次，加200μL Buffer，加 10μLAnnexinV-FITC，加 PI10μL，置于25℃，15 分鐘，加300μLBuffer，30 分鐘內(nèi)上機檢測，以上按照AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑/試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計方法 用SPSS18.0forWindows軟件分析數(shù)據(jù)。各組數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用One-WayANOVA方法，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大鼠SIRS模型建立效果 腹腔注射酵母多糖-石蠟溶液組大鼠呼吸急促，伴有明顯喘鳴，皮膚黏膜發(fā)紺，出汗，毛色灰暗，部分大鼠有鼻出血，腹脹，腹瀉。大鼠進食明顯減少，活動差，對外界刺激無反抗。殺鼠后，見SIRS組大鼠腹腔滲出增多，腸管擴張，程度不一。肝臟呈暗紅色或暗紫色。肺臟可見不同程度腫脹，部分可見充血出血點。心臟、腎臟、脾臟、胰腺無明顯大體改變。

2.2 HBO治療的影響

2.2.1 HBO對正常脾細胞凋亡的影響 在本次實驗中，經(jīng)過HBO治療的大鼠脾細胞凋亡有增加，但與正常組相比較，差異無顯著性(P＞0.05)。

2.2.2 SIRS狀態(tài)對大鼠脾細胞凋亡的影響 在本實驗中，SIRS狀態(tài)下大鼠脾細胞的凋亡率比對照組有明顯升高(P ＜0.05)。

2.2.3 HBO對 SIRS大鼠脾細胞凋亡的影響 在SIRS組中，HBO顯示了明顯的作用，無論是1次HBO組，還是3次HBO組，凋亡率均明顯減少(P＜0.05)，但此實驗中，1次 HBO組和3次HBO組并未發(fā)現(xiàn)有明顯差異(P＞0.05)。各組脾細胞凋亡比例分別是A組(13.30±8.94)%;B組為(16.25±11.24)%;C 組為(25.40 ±4.17)%;D 組為(12.91 ±3.67);E 組為(15.97 ±4.27)%。各組間比較，B組與A組比較，P ＞0.05;C組與A、B組比較，P＜0.05;D組、E組與C組比較，P＜0.05;D組與E組比較，P ＞0.05。

各組脾細胞凋亡比例的比較，見圖1。

圖1 各組脾細胞凋亡比例的比較

3 討論

SIRS概念是上世紀(jì)90年代提出，經(jīng)10余年的研究探索，發(fā)現(xiàn)從感染、創(chuàng)傷等病因發(fā)展到MODS的過程中，都存在著一條共同通路，即SIRS。SIRS具有以下特征:1)體溫＞38℃或＜36℃。2)心率＞90次/分。3)呼吸 ＞20次/分或 PaCO2＜32.33mmHg。4)血白細胞 ＞12×109/L或＜4 109/L，或未成熟粒細胞＞103。具備上述表現(xiàn)2種或以上可確認(rèn)為SIRS，上述標(biāo)準(zhǔn)后于2001年增加了炎癥指標(biāo)及高排低阻的血液動力學(xué)指標(biāo)，白細胞介素-6(IL-6)達 279 ～ 5979pg/L 被 認(rèn)為 存 在 SIRS[10]。Bone將典型的SIRS分成5個時期:第1期為局部炎癥反應(yīng)期，炎癥反應(yīng)局限于感染或損傷局部;第2期為全身炎癥反應(yīng)始動期，早期的促炎及隨后的抗炎介質(zhì)進入體循環(huán);第3期為全身炎癥反應(yīng)期，機體出現(xiàn)失去控制的，自我持續(xù)放大和自我破壞的炎癥，表現(xiàn)為播散性炎細胞活化、炎癥介質(zhì)泛濫形成瀑布效應(yīng)，并由此引起遠隔部位的炎癥反應(yīng)，引起組織損傷。第4期為代償性抗炎反應(yīng)綜合征(CARS)期，抗炎反應(yīng)過度，導(dǎo)致免疫功能抑制及對感染的控制和抵抗能力下降;第5期為免疫不協(xié)調(diào)期，表現(xiàn)為多臟器功能失調(diào)，病死率高，即MODS[11-12]。失控的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的免疫功能失調(diào)是SIRS狀態(tài)的特點。

細胞凋亡又被稱為程序性細胞死亡(PCD)，是一種重要的生命現(xiàn)象，不僅出現(xiàn)在生理情況下，更與腫瘤、自身免疫性疾病及退行性神經(jīng)病變等多種疾病密切相關(guān)。在近年來的研究中，細胞凋亡在SIRS到MODS的發(fā)生發(fā)展的過程中備受關(guān)注[13]。

SIRS狀態(tài)下，機體處于強烈應(yīng)激狀態(tài)，全身血流重新分布，胃腸、肝膽系統(tǒng)、腎臟甚至肺臟血管強烈收縮，內(nèi)臟缺血缺氧。持續(xù)的缺氧，長時間的高濃度兒茶酚胺刺激，內(nèi)源性阿片肰對腎上腺能受體(AR)的抑制等原因，使全身的AR敏感性降低甚至失敏，此時內(nèi)臟血管重新開放，造成內(nèi)臟組織的缺血再灌注損傷(IR)，自由基、炎癥介質(zhì)及細胞因子并大量釋放，內(nèi)臟瘀血缺氧，微循環(huán)障礙，細胞能量代謝障礙[14]。眾所周知，這些因素都可以導(dǎo)致免疫細胞和實質(zhì)細胞凋亡，免疫細胞大量凋亡的結(jié)果會導(dǎo)致免疫功能低下[7，15]，實質(zhì)細胞的凋亡則產(chǎn)生器官功能障礙[16]。

有研究證實，線粒體是缺血、缺氧損害的核心靶細胞器，線粒體損害是全身性缺血、缺氧損害的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。近年來的研究表明，細胞凋亡過程中，線粒體起到了至關(guān)重要的作用。線粒體是細胞生命活動控制中心，它不僅是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化的中心，而且是細胞凋亡調(diào)控中心，與凋亡相關(guān)的很多關(guān)鍵事件都發(fā)生于線粒體，在凋亡的線粒體途徑中，線粒體上的線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道(PT孔道)被認(rèn)為是細胞的生死開關(guān)，PT孔開放會引起線粒體跨膜電位ΔΨm下降和細胞色素C釋放，一旦線粒體跨膜電位因能量代謝障礙而耗散，細胞將進入不可逆的凋亡[17-18]。

HBO對機體SIRS狀態(tài)的治療作用是系統(tǒng)而不是局部的增加氧張力，提高氧分壓，可以改變血流攜氧方式，以物理溶解的方式向缺血組織供氧，增加氧的彌散距離，甚至能夠到達因微循環(huán)阻塞而紅細胞不能到達的組織，從而改善微循環(huán)，改善缺血、缺氧組織血供，甚至可以使組織達到無血存活。研究顯示，HBO治療可以減少致炎介質(zhì)的數(shù)量，有明顯的抗炎作用。HBO治療酵母多糖誘導(dǎo)休克的大鼠實驗研究證實，HBO治療減少SIRS狀態(tài)下TNF-alpha分泌[19]。創(chuàng)傷失血性休克復(fù)蘇后大鼠腸道組織TNF-alpha水平明顯升高，HBO治療顯著降低TNF-alpha水平，抑制過度炎癥反應(yīng)[20]。Kaelin等在鼠游離皮瓣移植應(yīng)用HBO處理的研究中發(fā)現(xiàn)，SOD活性明顯升高，從而減少氧自由基。HBO治療能夠改善缺血、缺氧組織的供氧，阻斷細胞能量代謝障礙，穩(wěn)定線粒體跨膜電位 ΔΨm[21]。

本實驗結(jié)果顯示，SIRS狀態(tài)下脾細胞凋亡明顯增加(P ＜0.05)，而HBO治療顯著降低了SIRS狀態(tài)下大鼠脾細胞凋亡(P＜0.05)。HBO治療1次與3次組并未有明顯差異(P ＞0.05)，這說明HBO治療能減少SIRS狀態(tài)下的脾細胞凋亡，且這種作用不依賴于暴露的劑量和時間。HBO治療減少脾細胞凋亡可能的機制，首先是HBO治療能改善機體缺血缺氧，改善微循環(huán)，保證能量代謝，維持 ATP水平，阻止線粒體損傷，防止細胞凋亡;其次HBO治療有抑制過度的炎癥反應(yīng)作用，減少TNF-alpha等炎癥介質(zhì)，從而抑制脾細胞凋亡;再次，HBO治療可能通過減少自由基的產(chǎn)生，抑制生物膜的脂質(zhì)過氧化，從而阻斷細胞的凋亡過程。

研究結(jié)果[23-25]，給予HBO治療，可以導(dǎo)致自由基產(chǎn)生，隨后SOD活性反應(yīng)性的升高，結(jié)果導(dǎo)致總體上自由基減少，但隨著治療劑量的增加，SOD的耗盡，自由基產(chǎn)生會再次增加。因此，HBO治療應(yīng)用于臨床，其治療時機、劑量，以及治療中抗氧化劑的應(yīng)用等都需要進一步研究。目前關(guān)于HBO治療能否阻斷SIRS狀態(tài)發(fā)展到MODS的研究已經(jīng)有所開展，本實驗表明HBO治療在這方面有廣闊的前景。

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